维真回答:(1)腺病毒和慢病毒均有各自的优缺点(见下表),应根据试验目的选择相应的病毒类型。(2)不同病毒在不同细胞中的感染效率存在差异,为帮助您选择感染效果较佳的病毒或血清型病毒,我们公司新研发出了“GFP-病毒检测试剂盒”,可迅速、准确地帮助您寻找到适合您细胞的病毒载体。
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腺病毒 |
腺相关病毒 |
慢病毒 |
基因组 |
dsDNA |
ssDNA |
ssRNA(+) |
囊膜 |
无 |
无 |
有 |
基因组大小 |
38-39kb |
5kb |
9kb |
感染类型 |
分裂和非分裂细胞 |
分裂和非分裂细胞 |
分裂和非分裂细胞 |
与宿主基因组相互作用 |
非整合 |
非整合 |
整合 |
外源基因表达时间 |
瞬时 |
潜在长效 |
长效 |
包装容量 |
7.5kb |
4.5kb |
6kb |
免疫原性 |
高 |
非常低 |
低 |
病毒滴度 |
10E10pfu/ml |
10E13vg/ml |
10E |
转染效率 |
100% |
70% |
70% |
外源基因表达量 |
高 |
中 |
中 |
1.什么是Adeno-associated virus (AAV) &重组 AAV(rAAV) & helper free rAAV?
腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科,是一类小的、二十面体、无包膜病毒。AAV是一种复制缺陷病毒,复制依赖于其他辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。AAV不编码自己的聚合酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。
重组AAV(rAAV)是人工改造的AAV,没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换为ITRs间的基因或结构,这使rAAV具有4.1-4.9 kb的包装容量。
2.使用AAV有哪些生物安全性要求?
可在生物安全1级(BSL-1)实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组AAV。另外,应在生物安全2级(BSL-2)实验室封闭处理具有生物危害性的材料。
3.重组AAV 安全吗?
迄今为止,未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV,在无需辅助病毒(如腺病毒)的存在下,复制效率非常低。重组腺相关病毒(rAAV)由多个质粒(cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒)组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列,因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。
4.重组AAVs的克隆容量有多大?
AAV具有〜4.7Kb的包装能力。2个ITR之间插入的DNA长度接近允许的较大值4.7Kb时,包装效率显著降低。例如,对于过表达来自cDNA的基因,CMV-poly(A)信号元件约为1KB,可包装的cDNA长度约为3.2kb,如果共表达GFP(约0.8kb),则可包装的容量大约为2.4kb。
5.哪些血清型的 AAV 可供选择?我该选用哪种AAV呢?
目前为您提供的AAV 血清型为AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6,AAV8 & AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。
AAV Serotype |
Muscle |
Hepatocyte |
Pulmonary |
Brain |
Retinal pigmented epithelium |
Pancreas |
Kidney |
AAV1 |
X |
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neuons and glial cells |
X |
X |
|
AAV2 |
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|
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|
|
|
X |
AAV5 |
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|
lung alveolar cells |
neuons and glial cells |
X |
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AAV6 |
X |
|
X |
|
|
|
|
AAV7 |
X |
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|
neurons |
X |
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|
AAV8 |
X |
X |
|
neurons |
X |
X |
|
AAV9 |
X |
X |
X |
|
X |
X |
X |
请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表,以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。
6.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?
rAAV病毒滴度很高,可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。
7.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体?
纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后,-80℃下长期保存。
8.订制AAV服务,客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?
您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选,或者提供您的质粒DNA或DNA序列,我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。
基因沉默服务,请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。
通常情况下,可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /ml。也可根据客户的需要,提供特定体积和滴度的产品。
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