CRISPR/Cas9载体构建与病毒包装服务

CRISPR/Cas9系统

      2013年2月的《Cell》报道了一种更为精确的基因打靶技术：CRISPR/Cas9介导的打靶系统。该技术自发明以来，迅速被接受并广泛应用于基因打靶研究中。

一．CRISPR/Cas的系统构成和免疫机制

      CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated）系统是细菌在噬菌体长期选择压力下，进化出的一种有效的获得性免疫机制。

      CRISPR簇广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是一个特殊的DNA重复序列家族。其由一个前导区（leader）、多个重复序列区（repeat）和多个间隔区（spacer）构成。前导区被认为可能是CRISPR簇的启动子，重复序列区可形成发卡结构，间隔区由俘获的外源DNA组成。

      CRISPR簇附近存在一个多态性家族基因，编码的蛋白质均具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性，并能与CRISPR区域发生相互作用，被命名为Cas（CRISPR associated）基因，目前已发现Cas1至Cas10。

      当外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体（pre-CRISPR RNA， pre-crRNA），并通过加工成为一系列含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。

二．CRISPR/Cas9系统的作用原理

      根据Cas蛋白质和参与序列的不同，将目前发现的CRISPR/Cas系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ型由Cas9单独参与，是研究深入的一种类型。

      在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRAN（trans-activating crRNA，tracrRNA）也转录出来。Cas9首先与crRNA和tracrRNA结合形成复合物，此复合物通过PAM序列（5’-NGG-3’）结合并侵入DNA，形成RNA-蛋白-DNA复合结构，进而在与crRNA配对的序列靶点剪切双链DNA。

      通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（single guide RNA），通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，便能够对目的基因进行操作，以引导Cas9对DNA的定点切割。

图1. CRISPR/Cas9系统的作用原理

（Zhang Feng，2013）

三．CRISPR/Cas9系统的优势

图2. CRISPR/Cas9系统优势

表1. CRISPR/Cas9与TALEN系统的比较

四． 维真为您提供CRISPR/Cas9腺病毒包装服务

      传统的CRISPR/Cas9系统往往通过质粒转染的方式进行，不仅转染效率低，而且由于作用时间短往往使得基因敲除效果不佳。相较于质粒转染，病毒感染具有更多优势。来自维真的CRISPR/Cas9腺病毒滴度高、纯度好，更好地满足您的实验需求。

图3. 维真提供的CRISPR/Cas9腺病毒载体图谱

基因组特定位点的精确编辑

TAL Effector Nucleases (TALEN) 服务

Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 转录激活样效应因子核酸酶是具有序列特异性的限制性内切酶，通过融合类转录激活因子效应物（TALE）的DNA结合结构域实现DNA的切割。

TAL 核酸酶具有基因组序列编辑的能力，可以将一段特定的双链DNA打断。打断后通过细胞DNA修复机制进行修复，或通过同源性或非同源性末端连接 (NHEJ)，产生敲除突变或在特定位点插入感兴趣的DNA序列。

通过这种机制，TALs可以被编程传递任何酶至任何位点并执行基因编辑功能，包括基因敲除、敲入、诱变、基因标记以及用于疾病和治疗模式的研究。

TALEN优点：

• 完全满足个客户需求: 可在任何种类的细胞中编辑任何基因
      • 位点/序列—基因组序列编辑
      • 应用广泛: 基因敲除、敲入、诱变、基因标记
** TALEN被Nature Methods 评为“2011年度优秀技术”

维真生物 TALEN服务主要特点：

      • 拥有一整套四聚体克隆，可直接用来组装16-21（碱基）重复单元
      • 连接和转化16-21（碱基）重复单元一步完成
      • 克隆全部经过全长序列测序

          一对TALEN 质粒可在订货后 48h 构建完成
      • 业内具竞争力的价格
            - 一组服务为4894元

     •交货规格 5-10ug DNA
      • 还可提供腺病毒载体服务
      • 提供在HEK293T细胞中功能验证服务