一、产品介绍

Vigenebio 慢病毒载体 可 具有各种标签和荧光标记 ，其中大部分都 具有与 Vigenebio率先推出的pEnter穿梭载体相同的MCS多克隆位点及筛选标记。Myc、Flag、 His、HA等融合标签方便改造，可依据您的需要添加在N端或C端。与质粒载体相比，慢病毒载体可以产生更加稳定的体外转染，Vigenebio提供的慢病毒载体如下：

用途	慢病毒载体
过表达	pLent-GFP-Puro-CMV pLent-RFP-Puro-CMV pLent-Puro-CMV pLent-GFP-Blasticidin-CMV pLent-RFP-Blasticidin-CMV pLent-Blasticidin-CMV（EF1a 启动荧光报告基因/筛选标记； CMV 启动插入基因，C 端融合 Myc-Flag 标签） pLent-EF1a-FH-CMV-GFP-P2A-Puro（EF1a 启动插入基因，C 端融 合 Myc-Flag 标签；CMV 启动荧光报告基因和筛选标记）
干扰	pLent-U6-GFP-Puro pLent-U6-RFP-Puro pLent-H1-GFP-Puro pLent-H1-RFP-Puro pLent-U6-Puro
其他	pLent-MIR-GFP-Puro pLent-MIR-RFP-Puro（microRNA 双标载体，可构建 microRNA 过 表达和 sponge 抑制克隆） pLent-EF1a-Puro-CMV-Luciferase

注：更多慢病毒载体信息可登陆 www.vigenebio.cn 网站查看或咨询 Vigenebio 技术支持。

慢病毒载体图谱：

注：更多载体图谱信息可登陆 Vigenebio 网站查看。

二、操作步骤

（一）慢病毒安全操作规范

Vigenebio 慢病毒载体是第三代慢病毒载体，其 3' LTR 的增强子功能发生缺失，形 成了自灭活（sefl-inactivating，SIN） 的 3’ LTR, 5’LTR 中的 U3 区替换成 CMV，是较安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警惕，严格按照以下操作规范进 行：

1．使用慢病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。

2. 请在 BL2 生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。

3. 请务必穿着实验服，佩戴一次性口罩和手套。

4. 小心操作，避免产生气雾、飞溅或洒落。

5.被病毒污染的超净工作台，请立即用加入 1% SDS 的 70%乙醇溶液擦拭干净；请务必 将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的 10％漂白粉、84 消毒液或

0.6%次氯酸钠溶液浸泡 1 小时以上再丢弃。

6. 装盛慢病毒的实验用品需单独放置及培养，并加以标示。

7.用显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，用 70%乙醇擦拭培养 瓶外壁后，显微镜下观察拍照。观察完毕，请用 70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。

8. 离心病毒时，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后进行离心，请尽量使用 组织培养室内的离心机。

9. 实验完毕脱掉手套后，请立即用肥皂和水清洗双手。

10.对共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。

（二）慢病毒感染目的细胞预实验

不同的细胞所使用的病毒 MOI 值会有所不同。建议在正式实验前，在目的细胞中进行 预实验摸索最佳 MOI 值。

为了节省病毒，推荐使用 96 孔板进行预实验。操作步骤如下：

1. 第一天 细胞的准备

将目的细胞接种于 96 孔板中，细胞融合率为 50%较佳。为保证细胞生长良好，请保 证细胞贴壁过夜。

2. 第二天 病毒的稀释

取 10μL 慢病毒原液加入 90μL 培养液中做 1:100 稀释（10-2），以此为起点做梯度稀 释直至稀释 10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

3. 第二天 感染目的细胞

取出提前准备好的 96 孔板，用准备好的病毒稀释液替代旧培养液，注意保留未加入病 毒的细胞孔作为对照组。

4. 第二至十天 观察荧光或检测

慢病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后 48、72、96、120 小时分别观察细胞中荧光 表达情况（如果您选择的产品不带有荧光标签，请在 48、72、96、120 小时分别收获细 胞并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达）。

注意事项：由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同，在加入病毒稀释液后，

请于 12-24 小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。

（三）慢病毒滴度测定

Vigenebio慢病毒单位为TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。 如：病毒滴度为>1×108  TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108个具有生物活性的慢病 毒颗粒。

慢病毒的病毒滴度（TU/mL）可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定，具体操作 步骤如下：

1. 第一天 细胞的准备

在96孔板中的每个孔中接种1-4×104个 HEK293细胞。

2．第二天 病毒的稀释和感染。 在Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为：每种病毒准备8个1.5mL Eppendorf 管，每管加入297μL完全培养液，向第一个管中加入33µL病毒原液，混匀后，吸取

30µL加入第二个管混匀。依此类推，做8个稀释度（10~10-6）。弃去96孔板中原有的培 养液，每个稀释度重复3个孔，每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。

实验预览如图：

1. 第五天 荧光计数和滴度计算

用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出后两个能观察到荧光的孔内的荧光细 胞数，计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数，假设为A（倒数第二个能见荧光 孔的荧光细胞平均数）和B（倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数）。 慢病毒病毒滴度计算公式：

病毒滴度 (TU/mL) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

（四）慢病毒感染目的细胞

进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液（培养目的细胞用）稀释。培养液中的血 清、双抗或其他营养因子不会影响慢病毒的感染效率。

以 24 孔培养板为例，进行 HEK293 细胞的感染实验操作步骤如下： 注意事项：实验前请按照不同的 MOI 设置不同的感染孔，并根据 MOI 和细胞数量计 算所需要的病毒量。

1. 第一天 细胞的准备

在 24 孔培养板接种若干孔，每个孔内接种 3-5×104 个 HEK 293 细胞，铺板时细胞的 融合率为 50%左右，每孔培养液体积为 300μL，进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右。

2. 第二天 病毒的准备

根据实验的实际情况和 MOI 值，用培养液准确稀释慢病毒原液。 注意事项：可使用 PBS 缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。

3. 第二天 感染目的细胞

在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液， 混匀后放于二氧化碳培养箱（37 ℃、5% CO2）孵育过夜。 注意事项：

1）感染前细胞的状态好坏对感染效果影响很大，请务必保证加入病毒前， 细胞处于良好的生长状态。

2）若慢病毒对目的细胞的感染效率较低，可通过提高 MOI 值提高病毒的感染效率，也可在培养液中加入助感染试剂 ADV-HR（详见附录 1、附录 4、附录 5）来提高病毒的感染效率。

4. 第三天 更换培养液

病毒感染细胞 24 小时后，更换培养液。 注意事项：换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用，影 响细胞生长状态，可于加病毒 4 小时后更换新鲜培养液后继续培养。

5. 第六天 感染效率检测 在倒置荧光显微镜观察荧光，计算慢病毒感染目的细胞的效率。如选择的慢病毒载体 不带有荧光标记，可以通过 Q-PCR(定量 PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。 注意事项：

1）慢病毒表达较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染 96 小时后观察荧光的表达。

2）感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对 目的细胞的感染情况。

3）感染期间，请根据细胞生长的情况及时换液，以保证细胞良好的生长状态。

三、附录

附录1. 常见问题解答

1.慢病毒感染后，细胞状态很差，甚至出现死亡，为什么？ 慢病毒会对细胞造成一定的毒性，不同细胞对毒性的耐受力不同。建议您 降低感染时使用的MOI值，即可在细胞准备时增加铺板细胞的融合率（可 提高至70%）或/和降低感染时加入的病毒量。此外，还可选择在感染4小 时后换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。

2.怎样提高慢病毒的感染效率？

细胞良好的生长状态和感染时适合的MOI值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的MOI值来提高病毒的感染效率，必要时可在感染 时加入助感染试剂ADV-HR来提高慢病毒的感染效率。

3.助感染试剂ADV-HR的使用浓度和使用方法是什么？

助感染试剂ADV-HR能够显著提高慢病毒的感染效率，并呈现剂量和时间依 赖效应（详见附录4）。但较高浓度的ADV-HR具有细胞毒性，影响细胞状 态和感染效率。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实

验。我们在HEK293中的实验表明（详见附录5），当ADV-HR使用浓度小于

等于1.0×10-2mg/mL时，细胞状态良好。 此外，对于较难感染的细胞系（如CNE2）建议使用“孵育法”，即将助感 染试剂、慢病毒和一定数量的细胞悬液加至1.5mL Eppendorf管中，轻轻

混匀，置于37℃培养箱中孵育0.5至1小时后转至培养皿中培养；对于较易 感染的细胞系（如HepG2）建议使用“直接加入法”，即在感染时，直接 将助感染试剂、慢病毒滴加至培养皿中。建议您针对目的细胞的具体情 况，选择合适的感染方法。

4. 慢病毒载体可插入多大的ORF片段？

一般情况下，慢病毒载体可容纳8 kb插入片段。然而，插入的ORF基 因大于4 kb时会大大降低病毒的包装效率，进而影响病毒滴度甚至基因表 达。

附录 2. Vigenebio 慢病毒感染 HEK293 细胞案例

10⁹TU/mL

MOI≈10

感染后 48 小时拍照

附录 3. Vigenebio 慢病毒滴度测定案例

3.046×10⁹  VP/mL

3.20×10⁸TU/mL

感染后 72 小时拍照

附录 4. 助感染试剂 ADV-HR 在慢病毒感染中的作用

10⁹VP/mL

感染后 48 及 110 小时拍照

附录 5. 摸索助感染试剂 ADV-HR 的使用极值实验

实验规模：96 孔板(定容至 100μL)

ADV-HR 浓度：1mg/mL

说明：

1． ADV-HR 终浓度在 0 至 1.0×10-2mg/mL 之间对细胞状态无影响；

2. ADV-HR 终浓度在 2.5×10-2mg/mL 时细胞生长缓慢；

3. ADV-HR 终浓度在 5.0×10-2 至 1.0×10-1mg/mL 时细胞呈现明显破碎， 2.5×10-1 至

5.0×10-1mg/mL 时细胞皱缩甚至停止生长。 建议：

1. 请在使用 ADV-HR 前于目的细胞中进行浓度梯度预实验；

2. 建议 ADV-HR 的使用浓度不超过 2.5×10-2mg/mL。

附录 6. 慢病毒(shRNA)感染构建稳转株成功案例

shRNA 载体：pLenti-U6-GFP    抗性：嘌呤霉素（Puromycin）    筛选周期：三周