Cre-loxP重组系统

一．Cre-loxP重组系统作用原理

1. Cre重组酶和loxP位点

Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点。

LoxP（locus of X-overP1）位点长为34bp，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。

      图1. Cre重组酶和loxP位点

（http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design）

2. Cre-loxP重组系统诱导基因重组的方式

 Cre-loxP系统存在几种诱导重组的方式，这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。

        当基因组内存在loxP位点时，一旦有Cre重组酶，便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随后，loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下，切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。主要存在几下几种重组方式：

（1） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列；

（2） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；

（3） 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；

（4） 四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。

图2. Cre-loxP诱导基因重组的方式

（https://www.tumblr.com/search/rolling%20circle%20replication）

二．Cre-loxP重组系统的优势

之所以Cre-loxP重组系统在转基因动物方面得到广泛的应用，因其具有非常明显的优势。主要体现在：时空特异、高效性、准确性、快速性。

图3. Cre-loxP重组系统的优势

三．Cre-loxP重组系统在转基因中的应用

由于Cre-loxP重组系统的高效简单的作用方式，它已在基因定点删除、外源基因定点整合、疾病动物模型建立、筛选高效表达基因座等方面得到了有效利用，成为体内外DNA重组的有力工具。

图4. Cre-loxP重组系统在转基因中的应用

四．病毒依赖的基因重组的优势

      应用Cre-loxP重组系统较为常见的形式是两种转基因动物的杂交。一般的策略为：

      （1） 利用原核注射的方法获得转基因“Cre小鼠”。一般利用特定启动子控制此小鼠的Cre重组酶的表达；

      （2） 通过置换型载体的同源重组，在胚胎干细胞中向靶位点引入选择标记基因，并在其两侧引入两个loxP位点，要求两条同源染色体都带有loxP位点，且不能干扰靶基因的转录。将此胚胎干细胞注入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”；

      （3） “Cre小鼠”与“floxed小鼠”交配，产生的后代体内，Cre重组酶会与loxP位点发生作用，导致基因重组。

      虽然此法具备了Cre-loxP重组系统的高效、特异的重组，但存在许多不足：

      目前，由于病毒依赖的基因重组能否克服转基因的动物的诸多不足，从而成为越来越多科研工作者的新选择。病毒依赖的Cre-loxP重组系统的策略为：

      （1） 通过转基因动物办法获得一只“Cre小鼠”或“floxed小鼠”；

      （2） 病毒注射此“Cre小鼠”或“floxed小鼠”，引入loxP或Cre重组酶元件。

      此方法优势明显：

五．维真为您提供Cre-loxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务

1. 依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统

结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型，维真提供的FLEX-ON系统能帮您获得更精准的组织特异性控制和时间控制。

        在FLEX-ON系统中，目的基因反方向位于启动子下方，两侧分别连接两个“头对头”的loxP。Cre重组酶不存在时，目的基因不能表达；当Cre重组酶存在时，可以诱导目的基因的“翻转”，从而表达。

图5.维真提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图（上）维真的FLEX-ON实验图（下）

2. 依赖Cre重组酶反式剪接系统——轻松拥有“表达大基因的AAV”

      较小的包装能力（小于5kb）使得AAV应用受到限制。维真为您提供依赖Cre的反式剪接系统，让您轻松拥有“表达大基因的AAV”。

多个重组AAV的共转染效率高达90%，维真将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上。通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的对转录的抑制作用，实现目的蛋白的表达。相比于单个载体ViGene提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20%。

图7. 维真提供依赖Cre的反式剪接系统示意图（左）维真的依赖Cre的反式剪接系统实验图（右）