腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近50个血清型,大多数腺病毒载体都是基于血清型2和血清型5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具,功能强大并易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”,被科研工作者广泛应用。
腺病毒主要具有以下特点:
1. 可广泛地感染各类细胞,包括分裂细胞和不分裂细胞(某些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞除外);
2. 高效率地感染细胞,感染率可达100%;
3. 可达到较高的病毒滴度,一般粗病毒可达1011vp/ml, 而浓缩后可达1013vp/ml;
4. 易于扩增;
5. 不整合到染色体中,无插入致突变性;
6. 稳定保存,-80 ℃可以保存2年以上。
Vigene生物使用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒。该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少,可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充,而E3基因不影病毒的包装。由于E1和E3基因的缺失,腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
Vigene生物的ORFAD-腺病毒ORF表达系统包括三个相关产品:ORF穿梭载体系统,pAD-ORF腺病毒载体和预制 ORF AD-腺病毒。
Vigene 公司率先推出了 pENTER穿梭载体,该载体与其他载体,如 腺病毒、慢病毒、腺相关病毒 和 shRNA载体 完全兼容。穿梭质粒中的ORF可以通过限制性内切酶简单的“剪切和粘贴”转移至所有目标载体和病毒载体。两组限制性内切酶 AsiSI/MluI (96%) 和 AsiSI/RsrII (99%) 可涵盖人类基因ORF的99.5%。其他的人类基因ORF,可由其他限制性内切酶组合, 如 AsiSI/NotI, AscI/RsrII 转移。ORF在CMV启动子启动下表达,在ORF的C'端融合了Flag和His标签,并具有SV40 poly(A)加尾信号。 pEnter载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记,可以用来进行稳转株的筛选。pEnter载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列,可用于将ORF序列同源重组到腺病毒载体。
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