三质粒共转染法

rAAV-PHP载体的构建方法与其他rAAV载体相同，最为经典的方法是三质粒共转染法。腺病毒作为辅助病毒的基本功能单位为E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA，采用基因重组技术把几种必须的辅助基因重组在一起便可得到具有和腺病毒相似辅助功能的辅助质粒。将分别带有目的基因、AAV 基因（Rep/Cap）、辅助基因的三种质粒共转染293细胞可包装得到rAAV-PHP。这种方法容易生产各种血清型，但步骤较为繁琐、成本较高、产量较低，且有野生型AAV的污染问题，目前适用于实验室研究，不适宜大规模生产。

 细胞系法

为了提高AAV的产量，方便大规模生产，对辅助质粒、病毒进行改进后，成功建立了重组AAV生产的细胞系。目前较为稳定的方法有两种，一种是利用腺病毒/AAV嵌合载体、辅助病毒共转染稳定的Rep/Cap细胞系，另一种是利用表达Rep/Cap的载体、表达目的基因及ITR的载体共转染293细胞进行生产。经临床经验证实，均可以大规模生产，且无非重组AAV的产生。但要注意的是，辅助病毒在临床应用中有安全隐患，必须清除，因此纯化要求高。

 杆状病毒表达系统

杆状病毒表达系统应用于昆虫细胞生产rAAV-PHP生产系统是一种简单、经济、高效的可以大规模生产rAAV的方法，已利用此方法成功制备了rAAV2。研究人员用分别编码Rep、Cap和带有两ITRs侧翼的外源基因的三种不同重组杆状病毒共同感染昆虫细胞，昆虫细胞中生产的病毒颗粒与使用哺乳动物细胞（293细胞）生产得到的病毒颗粒在生物功能上没有区别，同时，昆虫细胞单细胞生产病毒颗粒的量相比哺乳动物细胞增加了5倍。按照同样的思路，通过替换表达AAV-PHP Rep和Cap基因的辅助质粒，能够将带有AAV-PHP型ITRs的外源基因包装入AAV-PHP衣壳。这种生产方法的优点是：高产、易放大，其生产规模也从摇瓶发展到生物反应器规模，最大体积可以达到40 L。但要注意，在这一生产系统中，AAV启动子必须进行修饰以使基因在昆虫细胞中得以表达。