AAV在肝脏及眼部疾病基因治疗中的应用

基因治疗是近年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术，其基本原理是，将外源基因即治疗基因通过载体系统导入靶细胞后，与宿主细胞内的基因发生整合，成为其遗传物质的一部分，以纠正或补偿基因缺陷或缺失引起的疾病，从而达到治疗目的^[1]。基因治疗载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用，目前常用的基因治疗载体主要包括病毒类和非病毒类两种。病毒类载体是当今基因工程研究的热点之一，主要包括取代型的重组病毒载体和重组的病毒质粒载体，包括逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)。重组腺相关病毒（rAAV）以其安全性好、宿主范围广、免疫原性低、携带外源基因可长期表达等优点而备受关注^[2]，广泛应用于人类和动物相关疾病的基因治疗，本文将对rAAV在肝脏和眼部疾病的基因治疗中的应用进行综述。

1. AAV的生物学特性

1.1 AAV基因组结构和功能

AAV属于细小病毒家族的依赖病毒属，是动物病毒中的小病毒，于1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分被发现。其基因组为4.7 kb左右的单链DNA片段，包含于直径20 nm的正二十面体非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框（Rep基因、Cap基因）和末端反向重复序列（ITRS）。Rep基因的开放阅读框编码4个多功能非结构蛋白家族（Rep）蛋白，即Rep40、Rep52、Rep68与Rep78，主要功能涉及病毒/载体基因组的复制、转录的调控、整合以及AAV基因组的组装^{[3, 4]}。Cap基因的开放阅读框编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，分子量为别为87、73、61 kDa，是装配成完整病毒所需的衣壳蛋白，它们在病毒整合、复制和装配中起重要作用^[5]。衣壳蛋白序列之间的差异导致不同血清型的AAV与不同的细胞表面受体结合，这使得不同 AAV血清型具有不同的组织嗜性^{[4, 6]}。末端反向重复序列（ITRS）在AAV基因组的5’和3’末端形成两个T字形结构，作为复制起点并在病毒基因组整合入宿主基因组，在随后的从整合状态中拯救病毒DNA的过程中均发挥了非常关键的作用^[7]。

AAV是一种缺陷性病毒，不能独立存在，只有在辅助病毒如腺病毒（Ad）、单纯疱疹病毒（HSV）等存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中复制合成装配蛋白，产生新的病毒颗粒。当无辅助病毒存在时，野生型AAV只能被定点整合到宿主细胞第19号染色体长臂上，形成潜伏性感染，病毒DNA随宿主细胞染色体的复制而复制，无AAV颗粒产生^[8-10]。

1.2 AAV的血清型

目前发现的AAV基因型有200多种，根据抗原性的差异分为不同的血清型，在人类中共发现AAV1~AAV11、DJ等12种不同的血清型^{[11, 12]}。不同血清型主要区别在于衣壳蛋白Cap的不同，并决定不同血清型AAV对不同的组织和细胞有不同的感染效率。研究表明，肝脏亲和性高的AAV血清型主要有AAV7、AAV8、AAV9，其中AAV8 在目前应用的AAV载体中嗜肝性较强，携带目的基因的载体在动物体内可以形成稳定的肝脏转染，常被用作肝脏的相关研究（12-17）；AAV1、AAV2、AAV5血清型均可有效转染主感光器和视网膜色素上皮细胞，用于治疗眼部疾病。AAV2是人体中主要存在的血清型，正常人群中超过80%存在AAV2的中和抗体，因而临床上应用AAV2会导致治疗效果受限^[13]。

1.3 rAAV载体

ITRS是AAV病毒基因组复制和包装成病毒颗粒所必需的唯一顺式作用元件，其他结构和非结构蛋白可通过反式作用提供。rAAV的构建通常涉及rep 和cap 基因的剔除和报告基因或治疗基因插入ITRs元件之间，产生的载体质粒随后与一个表达AAV的rep和cap基因的包装质粒一起共转染到组织培养细胞中。带有报告基因或外源基因的重组AAV基因组就会被拯救、复制和包装成rAAV^[11]，如图1所示。

图 1  AAV野生型及AAV载体基因组结构

从1966年第一篇报道发现AAV是独立于腺病毒的新病毒起，到1984年第一篇应用rAAV为载体感染哺乳动物细胞的文章发表，rAAV作为一种新型病毒载体引起广泛关注，目前对其应用研究主要集中于以之为载体的基因治疗^[10]。相关临床应用的推进过程较为慎重缓慢，将rAAV注射进机体组织中，可以在动物或人体内获得长期有效的转基因表达，所涉及的组织器官包括肌肉组织、造血干细胞、心血管系统、肿瘤组织、中枢神经系统、呼吸道和肺的上皮组织等，其中有效的是骨骼肌、脑、视网膜、肝脏、肠道固有层，所涉及的疾病包括ɑ1-抗胰蛋白酶缺乏症、老年性肌肉萎缩、凝血因子缺陷症、帕金森病、肿瘤等。

但rAAV载体在应用时也要注意一些不足之处，如包装外源基因的容量小于4.7 kb、滴度低和表达“滞后性”，即被转染细胞重组AAV-DNA转变为转录活跃的双链模式需要一定的时间等^{[2, 5]}。

2. rAAV在肝脏疾病基因治疗中的应用

2.1 肝脏及肝脏疾病

肝脏是人体最大的实质性器官，也是人体的代谢中心器官，参与分泌胆汁、代谢、凝血、解毒及免疫等多项重要而复杂的生理功能，承担着人体内营养物质的消化，能量转换，解毒等重要的代谢功能。

肝脏是很早被用于基因治疗的器官之一，国内外科研人员开始探索利用日新月异的分子生物学技术对肝脏疾病进行基因水平上的治疗，力图走出对症治疗的常规思路，从根本上阻断肝脏疾病的发生发展。但随着研究的深入，人们发现肝细胞是很难转化的细胞之一。然而，病毒载体的出现使这一难题的解决成为可能。

重组腺相关病毒（rAAV）以其安全性好、宿主范围广、免疫原性低、携带外源基因长期稳定表达等优点而备受关注，被认为是目前较好的载体。

2.2 rAAV载体在肝脏疾病基因治疗中的应用

目前，大多数rAAV 在肝病研究中的应用是利用病毒的高感染性将目的基因带入细胞进行表达。研究表明，rAAV载体可通过肝内注射或静脉注射的方法进入实验动物体内，可实现对肝细胞的稳定转染及外源基因在血液循环和靶组织中治疗水平的表达。系统性给药之后，rAAV显示出显著的肝脏趋向性。研究表明，从大鼠门静脉和尾静脉给予rAAV都可以观察到肝脏中较高水平的目的基因表达，而且大多数文章报道这种表达可以持续至少6个月，没有发现炎症等不良反应，从门静脉注射比尾静脉的表达水平高50%左右。

      2.2.1 rAAV在肝脏先天性疾病基因治疗中的应用

先天性血色病是由先天性铁代谢异常造成的铁过量沉积于肝脏、胰脏和心脏等实质器官导致的疾病，有报道指出，携带目的基因FIX的rAAV5或rAAV8通过静脉注射后，可经门静脉循环后进入肝脏内部发挥作用，对先天性血色病B的治疗有效^[14]。

      2.2.2 rAAV在肝脏肿瘤基因治疗中的应用

抑制肿瘤内的血管生成是一种公认的肿瘤治疗方法。通过使用rAAV 携带拓扑异构酶抑制剂内皮他丁的基因序列，转入肝癌小鼠模型中，虽然并没能起到抗肝癌的作用，但却增强了肿瘤的响应^[15]。rAAV介导的次级淋巴组织趋化因子在实验模型体内的局部表达可刺激瘤床，产生强抗肿瘤作用^[16]。载脂蛋白酶A是一种由多聚Kringle功能域和蛋白酶样功能域组合而成的纤溶酶原同源性的糖蛋白，rAAV介导的载脂蛋白酶A可在实验肝癌小鼠模型体内有效的抑制肝癌细胞的生长[17]。AAV2载体携带的p53、金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP1）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）、干扰素（IFN）、内皮抑素（ES）和血管抑素（AG）等基因，在结肠癌、肺癌和肝癌等动物实验中显示了很好的抑制肿瘤发生、肿瘤血管形成和肿瘤生长作用, 提高了动物的抗肿瘤免疫功能及其生存率。

      2.2.3 rAAV在肝纤维化及相关疾病基因治疗中的应用

rAAV的介导INF-γ能有效抑制肝星状细胞的活性，使平滑肌肌动蛋白α-SMA和TIMP-1、转化生长因子TGF-β 在mRNA水平上的降低，在体内实验中可有效抑制肝纤维化的进程。此外，将INF-α和INF-γ，IL-10和IL-12通过rAAV为载体直接将目的基因转入细胞，均能起到抗肝炎病毒的作用^[18]。通过rAAV负载刺激树突状细胞（DC），使之提呈抗原给细胞毒性T淋巴细胞，可产生特异性的杀伤作用，也具有抗肝炎病毒效果^[19]。

乙型肝炎病毒（HBV）的免疫清除主要依赖于特异性的CD8+ HBV和适当的CD4+辅助性T淋巴细胞。通过体外特异性地抗原刺激DC，活化CTL可以达到杀伤HBV感染的宿主细胞的作用。Shimizu 等^[20]用DNA疫苗免疫HBV转基因小鼠时，仅产生抗HBs而不产生对HBV特异的CTL反应。当输人体外活化的DC时，不仅产生抗HBs，而且也产生针对HBV表面抗原特异的CTL反应，提示活化的DC比DNA疫苗更有效地介导细胞免疫应答，从而达到清除HBV的作用。

以上所述的多种研究表明，rAAV可以成功感染肝脏细胞，并将外源基因接到进入肝脏细胞中，使其在靶细胞中正确高效地表达。因rAAV 载体所搭载的外源基因的不同作用，其外源基因片段通过瞬时表达或稳定整合在肝细胞中复制并表达，可对肿瘤及肝纤维化相关基因的表达进行调控，也可表达特异性的蛋白以起到抑制肝细胞的癌变或纤维化进程，临床研究发现如果注射2X10¹²vg/kg高剂量的rAAV，将会导致肝脏血清转氨酶増加，对肝脏造成损伤。因此需要不断优化AAV载体，使其更适合应用于基因治疗。

      3. rAAV在眼部疾病基因治疗中的应用

眼睛由于个体小、相对封闭、具备免疫赦免特性，成为基因治疗中非常热门的器官，眼部疾病错综复杂，基因治疗的兴起为遗传性眼部疾病（如视网膜色素变性、Leber先天性黑朦和缺血性视网膜疾病等），甚至病理性眼部疾病（如青光眼、视网膜病变等），以及其他眼部疾病（视神经损伤等）的治疗带来希望。

3.1 rAAV感染途径

AAV载体介导的眼部基因转移途径依治疗目的不同主要有玻璃体腔注射、视网膜下注射、前房注射、结膜下注射等。研究表明^{[21, 22]}，在多种动物模型中，AAV载体玻璃体腔注射主要转染神经节细胞和Mǜller细胞，会产生针对AAV衣壳蛋白的体液免疫反应，这种反应可阻碍再次注射时AAV的表达；视网膜下注射主要转染视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞，不会触发体液免疫反应，对另一只眼再次视网膜下注射也无影响，说明视网膜下腔对眼球的免疫赦免特性起着重要作用。

3.2 rAAV在遗传性眼部疾病基因治疗中的应用

遗传性视网膜变性是由于某一基因变异、功能缺陷而产生的一组视网膜疾病，治疗时把正常基因导入视网膜靶细胞，产生正常的基因表现型稳定表达即可。

英国研究者对3例RPE65基因变异导致的Leber先天性黑矇患者进行了一项临床试验，他们将rAAV2-hRPE65-RPE65注入一侧患眼视网膜下腔，观察6-12月, 未见眼部的不良反应，病毒无眼外扩散，3例均未检测到有临床意义的视力提高和周边视野的改善，但1例患者的微视野检查及暗适应视野检查显示视网膜光敏感度提高，障碍试验提示视觉活动能力得到改善^[23]。

     光感受器产生了异常蛋白或基因产物错误表达，对光感受器产生毒性作用进而通过凋亡作用诱导细胞死亡，造成视力障碍，可以通过消除或者矫正错误基因来挽救视功能。Gorbatyuk等^[24]在P23H基因突变鼠的视网膜下注射携带独立等位基因核酶Rz525的rAAV2/5载体, 12周后检测显示能显著保护实验眼暗适应ERG的a波和b波的振幅，RT-PCR分析表明P23H鼠视紫质mRNA减少46%，视网膜结构分析表明基因转移能阻止视网膜外核层的变性。

3.3 rAAV在病理性眼部疾病基因治疗中的应用

增生性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变、老年性黄斑变性等疾病导致视网膜脉络膜微环境不稳定，诱导视网膜和脉络膜新生血管形成，会导致视力丧失。Mor等^[25]在C57BL/6小鼠玻璃体腔或视网膜下注射携带色素上皮衍生因子（PEDF）的AAV载体，然后制作脉络膜新生血管模型，4-6wk后观察发现脉络膜新生血管的面积显著减少，提示AAV可介导PEDF或其他抗血管因子抑制眼内新生血管的发生。

青光眼视神经病变中视力损害主要是由于视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡丢失所致。近几年来，研究者试图通过基因治疗方法保护青光眼视网膜神经节细胞功能。Martin等^[26]将脑源性神经营养因子(BDNF)和肝炎病毒转录后调控原件(WPRE)构建到重组AAV的载体中，将上述重组病毒注入小鼠玻璃体腔，2周后用激光制作实验性高血压模型，4周后计算视神经通过筛板的轴突量，轴突丢失率为32.3%，而对照组轴突丢失率为52.3%，证明通过AAV载体基因转移使视网膜高表达BDNF能有效拯救神经节细胞的数量。

3.4 rAAV在视神经损伤基因治疗中的应用

视神经损伤后，其所处微环境发生改变，内部分子的表达发生变化，视网膜神经节细胞逐渐死亡，若缺乏有效的治疗手段往往导致失明^[27]。CNTF是目前使用较多的保护损伤后视神经的营养因子，无论是体内还是体外的使用，都能有效支持视网膜神经节细胞（RGCs）的存活，BDNF NT-4/5等也能在视神经损伤后增强RGCs的存活能力^[28]。通过rAAV介导的基因治疗，使这些因子在体内按照生理所需水平持续释放，可较好地发挥作用。

此外，3 种主要的生长抑制因子MAG、Nogo和OMgp，通过其共同的受体NgR，激活下游Rho/ROCK信号途径，造成生长锥的塌陷，从而抑制轴突的再生。Venkatesh等的研究证实, NgR基因敲除的突变小鼠，其RGCs的存活和轴突再生能力明显增强^[29]。

4. rAAV载体在肝脏和眼部疾病基因治疗中的应用局限性和展望

病毒载体对靶组织细胞的感染效率和靶向性是基因治疗中选择适当病毒载体的必要指标。研究表明，rAAV1、rAAV2、rAAV5均可有效用于眼部疾病的基因治疗，且亲和性较高，但对目的基因的研究尚不十分明确。但rAAV各血清型对肝细胞转染效率偏低以及其靶向特异性的欠缺制约了其在肝疾病基因治疗领域中的应用。通过大量实验研究证实，选择合适的腺相关病毒血清型和开发含有不同血清型病毒壳蛋白的嵌合体病毒，以及对病毒基因组进入细胞中整合于表达调控机制的深入研究，将有可能解决rAAV对肝细胞感染效率偏低的问题。AAV8 能跨越存在于内皮细胞和血管之间的屏障而转染该种组织和细胞，与其他血清型AAV载体相比，AAV8载体转导肝脏的效率提高了10~100倍，并使得肝细胞获得了高水平的外源基因表达。而通过在病毒载体中添加特异靶向肝细胞相关基因以及构建在肝细胞中可使外源基因特异或高效表达的调控序列元件可对rAAV靶向肝组织的特异性研究拓展方向。

5. 总结

综上所述，重组AAV载体是肝脏和眼部疾病基因治疗中有应用前景的基因转移载体。进一步深入研究AAV的病毒生物学基础，选择对特定靶细胞有亲嗜性的AAV血清型或AAV杂合体，设计更多的组织特异性启动子以提高AAV载体的转染效率、靶向能力和安全性将为人类肝脏和眼部疾病的基因治疗带来新的曙光。

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