AAV在中枢神经系统研究中的注射方法

 中枢神经系统是由许多不同类型的细胞构成的，包括神经元和神经胶质细胞。其中，根据不同的形态、大小和功能，神经元可以分为很多类型。而神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。

      AAV在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中的应用包括很多方面，比如在神经系统疾病和中枢神经系统损伤中的研究和治疗，以及某些神经系统疾病模型的局部转基因研究等。

      由于AAV的血清型、转录因子和注射位点的不同，AAV在大脑中介导的转基因通常不是均一的，这种不均一表现在时间和空间（不同细胞种类的特异性）方面。除此之外，AAV病毒制备的技术（影响纯度和滴度）、病毒注射的方法也会大大影响到AAV介导的转基因的效率。值得注意的是，AAV感染后所使用的检测方法和目的蛋白的自然属性（胞内蛋白/分泌蛋白/转运蛋白）等因素也会影响到最终对转基因效果的评价。组织学染色，比如免疫组化或单/双免疫荧光可以帮助观察转基因表达的分布特征，但却不能量化评价病毒感染的效率。对脑提取物进行ELISA或RT-qPCR可以定量转基因效率。

      事实上，通过将AAV直接注射大脑或大脑外围区域（肌肉或静脉注射）能够产生不同的转导模式。已经有文献证明AAV9可在小鼠/猫和非人灵长类动物中穿过血脑屏障。并且，AAV载体可以从肌肉逆行运输到脊髓运动神经元（27-30）。简单来说，就是运动神经元的轴突接触到AAV病毒，并将其传递给胞体。实验表明，AAV1的逆行效率较高。本文主要介绍几种在神经科学研究中常用的AAV注射方法。

一．通过立体定位仪直接向脑内注射AAV（需佩戴手套和口罩）

      目前，成年雌雄大鼠和小鼠的大脑图谱都可通过文献和书籍获得。立体定位手术时，颅骨上常用的注射参照点就是前囱，也就是中矢状冠状缝的交叉点。具体的注射部位，可依据研究的需要而确定。微创技术可以避免炎症，以降低转导细胞的排斥反应。

  1.安装定位仪: 在生物安全柜中安装立体定位框架和工具。

  2.准备并吸满病毒悬液：在喷嘴出安装超微量注射器，把针尖浸在准备好的AAV病毒悬液中，并使用“快速反向”功能吸满。

  3.排除空气：使用“快速正向”功能检查泡沫，知道在针头处出现一滴液体。用浸泡在0，1M NaOH溶液中的棉花轻轻拭去针尖的液滴。

  4.麻醉大鼠：选取250g左右的大鼠，通过25 G 1毫升注射器注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）。

  5.固定大鼠：首先将大鼠的下切牙固定在齿棒上，然后用耳棒通过大鼠的外耳道进行固定，并固定头部。检查颅骨是否是水平的，并确保两个眼睛在同一水平线上。在每只眼睛中滴入一滴聚丙烯酸，以防麻醉造成眼睛干燥。调整光源对准大鼠的头部，剃去头部的毛并用酒精消毒清洁。

  6.切口并暴露前囱点：用刀片在头皮上前后轴切口，并用钳子保持刀口开放状态，用棉球吸去血。去除骨膜以便看到前囱。

  7.暴露λ点：调整齿夹的垂直位置，使得前囱点和λ点的高度一致，如果λ点的位置难以看到，让切口处干燥5-10min后再寻找。

  8.确定前囱点的AP和ML坐标和目标注射点的距离：将针垂直于前囱点，并记录AP和ML坐标的数值。参考大鼠脑图谱的标记的目标注射部位的AP和ML值，计算前囱点与目标注射部位的AP和ML坐标，并做标记。

  9.确定前囱点的DV坐标和目标注射点的距离：用钻头在颅骨上打洞，注意不要损伤硬脑膜。把针尖置于硬脑膜的表面并测量出前囱点DV的坐标。计算目标注射部位的DV坐标。

  10.注射AAV：缓慢垂直移动注射器针尖到达目标注射部位，慢慢地将针插入并静置5min。然后，以0.2 μ l/min的速度，将2μL的病毒悬液注射入脑。结束后，需要静置5min再将注射器缓慢移出。

  11.缝合并做标记：缝合头皮，并做耳标。

  12.大鼠术后的护理：将大鼠单独放在一个干净的笼子里，直到醒来。第一天需要让大鼠在独立的通风笼中度过。

  13.处理针头和手术材料：先用0.1 M NaOH or 10%氯漂白剂清洗手术工具，并用蒸馏水冲洗，后用酒精冲洗。

 图1：脑立体定位仪。（1）耳棒；（2）齿棒；（3）注射器支架；（4）设置垂直坐标的螺钉；（5）设置横向

坐标的螺钉；（6）设置前后坐标的螺钉；（7）垂直游标刻度；（8）侧游标刻度；（9）前后游标刻度。

二．静脉注射AAV9

（一）新生小鼠的颞静脉注射

  1. 调整光源位置以便照亮显微镜区域，中等强度的光照最佳。

  2. 将一个新生幼鼠直接置于冰上1-3min，进行麻醉。

  3. 当动物在冰上麻醉时，在注射器中注满AAV病毒。体积不应超过100μL，体积在30到100μL之间不会影响转导效率。

  4. 在显微镜下观察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻处，中指放在耳芽处，以便拉伸幼鼠的皮肤，可见颞浅静脉。

  5. 确定颞浅静脉。可通过皮肤看到位于耳芽前部，周围毛细血管下部，有一条隐约可见的静脉血管，从背部到腹部，汇入颈静脉，这就是颞浅静脉。

  6. 注射器针尖斜面插入颞静脉。可以看到针尖斜面通过皮肤的以后被血填充。轻压注射器，并注意幼鼠脸侧面的静脉变白。

（二）成年小鼠的尾静脉注射

  1. 确保动物进入约束装置。

  2. 用酒精擦拭尾巴。

  3. 把尾巴置于温水中。

  4. 将注射器吸满AAV病毒悬液。

  5. 将注射器插入尾静脉中。如果没有瞄准，可以靠近尾巴根部再试一次。

  6. 注射病毒溶液。体积控制在100-250μL。

  7. 将小鼠放回笼内。

                                              图2：动物约束装置

三．AAV从周围神经到目标神经元的逆行运输

  1.选取250g左右的大鼠，通过25 G 1毫升注射器注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）。

  2.将麻醉后的大鼠置于无菌布上。在每只眼睛中滴入一滴聚丙烯酸，以防麻醉造成眼睛干燥。

  3.刮去肌肉附近的毛发并用酒精清洁。用刀片在皮肤上切一个小口，并用钳保持刀口开放，以暴露肌肉。

  4.使用超微量注射器吸入AAV病毒悬液，并排除空气和气泡。

  5.挤压肌肉以使肌肉建立起一定的厚度，并把针尖置于肌肉上。

  6.缓缓插入针尖，并在肌肉中静置1min。然后以10μl/min的速度注入10-20μl的AAV悬液。

  7.注射结束后，将针在肌肉中静置2min，然后缓缓拔出。可进行多次注射。

  8.缝合皮肤并做耳标。将大鼠单独放在一个干净的笼子里，直到醒来

  9.先用0.1 M NaOH or 10%氯漂白剂清洗手术工具，并用蒸馏水冲洗，最后用酒精冲洗。

                                                                图3：超微量注射器