1、去掉细胞培养上清液，加入PBS 洗去残留的培养基;

　　2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大 时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

　　3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格， 每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以 4(得每大格细胞数)，再乘以 10(10 倍稀释)，即为实际 n 万/mL 细胞浓度。

　　4、细胞离心，1000 rpm/min，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO)

　　重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml。

　　6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。

　　7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏 细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。

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