VSV-G-假型自我灭活慢病毒载体是不可或缺的生物实验工具之一,与之前的γ-逆转录病毒载体不同的是,慢病毒载体可转导非分裂细胞,并可携带更多的转基因盒,在细胞中的转基因表达时间也更长,即可获得更高的滴度,而其遗传毒性相对较低。
一般情况下产毒细胞上清液中的载体滴度足以转导常规细胞系,但原代细胞较难转导,需要进行载体浓缩以获得较高浓度。此外,一些载体因整合了会降低滴度的遗传元件,且大多数细胞类型也不耐受产毒细胞生长培养基或其分泌蛋白,所以浓缩及漂洗是慢病毒载体使用的必要步骤。
超速离心是病毒颗粒浓缩的常用方法之一,但其浓缩系数较低,每次处理量也偏小,且繁琐的多步操作会降低病毒颗粒回收率。离心过滤是相对较简单的浓缩方法,但过滤器本身会捕获截留大量载体,造成损耗。相较而言,切向流过滤(TFF)操作简单,损耗低,且可通过洗滤过程有效降低产毒细胞代谢物及分泌蛋白,但传统的一步式TFF浓缩程度仅可达50-100倍,本实验使用两步TFF,成功将5.5L 慢病毒载体原液浓缩至1mL左右,且回收率高达97%以上。而对终产物的质量分析显示,浓缩的慢病毒载体可有效转导原代人CD34+造血干/祖细胞和原代人纤维母细胞,且无明显毒性。
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