一．关于自噬及LC3

1. 自噬

大自噬（macroautophagy），也就是通常说的自噬（autophagy），是真核细胞蛋白降解的途径之一。自噬可以被描述为细胞质内的成分（细胞器、蛋白等）被双层膜的囊泡包裹，形成自噬体（autophagosome），进而传递到溶酶体进行降解的过程。详细来说，自噬过程与内涵体途径（endolysosomal pathway）密不可分（见图1）。一方面，自噬体能够与晚期内体（late endosome）融合形成中间囊泡（amphisome）最终形成自噬溶酶体（autolysosome）；另一方面，自噬体能够直接与溶酶体（lysosome）融合形成自噬溶酶体。无论通过哪条途径，自噬溶酶体最终通过酸性水解酶将细胞器、蛋白等消化分解。

细胞本底水平的自噬发生在营养充足的条件下，可保护细胞免受错误折叠蛋白或受损细胞器的影响，从而防止某些疾病的发生（如神经退行性疾病和癌症）。饥饿等也可诱导自噬的发生，通过降解大分子物质和细胞器为细胞活动提供营养和能量。

图1 自噬过程及其与内涵体途径的关系

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

2. LC3

LC3（light chain 3）简称于MAP1LC3(microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。

LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II并定位于自噬体膜上（见图2）。哺乳动物中的LC3可分为三种： LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。

图2  LC3在自噬体形成中的作用

(Varuna C. Banduseelaet al，Phyciological Genomics，2012)

二．自噬流检测方法

细胞经自噬诱导或抑制后，需对自噬流的水平进行观察和检测，常用的技术手段见表1：

表1 自噬体计数及自噬流检测方法汇总

（Mizushima et al, Cell, 2010）

其中，电镜观察法由于受到实验条件和设备的限制应用范围有限；而由于自噬过程发生快速，通过IB/WB检测LC3-II水平和GFP-LC3的方法易受到实验进行时长的影响。

想要准确检测自噬流的变化，需要多种技术手段共同使用，才能达到理想的实验效果，产生具有说服性的实验结果。

三．维真自噬双标病毒产品

维真 mCherry-GFP-LC3B腺病毒

维真 mCherry-GFP-LC3B慢病毒

维真 mCherry-GFP-LC3B腺相关病毒

四．维真自噬双标系统的工作原理

未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中，由于mCherry与GFP共同表达，细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭，而mCherry不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多，绿色荧光越少，则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻（见图3）。

 

图3mCherry-GFP-LC3B双标系统工作原理

(Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011)

图4. 维真自噬双标病毒载体图谱

五．维真自噬双标腺病毒操作方法

（一）腺病毒安全操作规范

1．使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。

2.  请在BL2生物安全二级生物安全柜中操作病毒粒子。

3.  请务必穿着实验服，佩戴一次性口罩和手套。

4. 小心操作，避免产生气雾、飞溅或洒落。

5. 被病毒污染的超净工作台，请立即用加入1% SDS的70%乙醇溶液擦拭干净；请务必将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的10％漂白粉、84消毒液或0.6%次氯酸钠溶液浸泡1小时以上再丢弃。

6. 装盛腺病毒的实验用品需单独放置及培养，并加以标示。

7. 用显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。观察完毕，请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。

8. 离心病毒时，应使用密封性好的离心管，或用封口膜封口后进行离心，请尽量使用组织培养室内的离心机。

9. 实验完毕脱掉手套后，请立即用肥皂和水清洗双手。

10. 对共用实验室的人员需进行腺病毒安全培训或提示。

（二）腺病毒感染目的细胞预实验

不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议在正式实验前，在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI值（使用Vigene腺病毒感染HepG2、A549和Hela细胞的参考用量见附录6）。

为了节省病毒，推荐使用96孔板进行预实验。操作步骤如下：

1. 第一天细胞的准备

将目的细胞接种于96孔板中，细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。

2. 第二天病毒的稀释

取10μL腺病毒原液加入90μL培养液中做1:10稀释（10^-1），以此为起点做梯度稀释直至稀释10^-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

3. 第二天感染目的细胞

取出提前准备好的96孔板，用准备好的病毒稀释液替代旧培养液，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

4. 第二至四天观察荧光或检测

腺病毒对细胞的感染较快，请在感染细胞后12、24、36、48小时分别观察细胞中荧光表达情况（如果您选择的产品不带有荧光标签，请在48、72、96、120小时分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达）。

注意事项：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，请务必保证加入病毒前，细胞处于良好的生长状态。

（三）Quantitative-PCR腺病毒滴度测定    

实时定量PCR法是一种简单的、高通量的测定病毒粗提裂解液和纯化病毒样本中腺病毒颗粒数量的方法。该方法用腺病毒基因组特异性引物进行实时定量PCR。在定量曲线的线性范围内，Ct值与已知拷贝数质粒的Ct值的比值即为病毒基因组的初始拷贝数。

1. 纯化腺病毒基因组DNA

腺病毒颗粒基因组DNA外面包被有衣壳蛋白，使用蛋白酶K消化酶解病毒衣壳。

组成成分               体积

病毒液                                        5µl

蛋白酶 K (5µg/µl)                   1µl

超纯水                                        4µl

1） 37 ºC 孵育30 min。然后加热 95 ºC 20 min 使酶失活；

2）3000g 离心10 min，取上清冻存。

2. QPCR:

1）维真使用的病毒标准品的滴度为 3.6×10⁸VP/mL。梯度稀释标准品至滴度为 3.6×10²-3.6×10⁸，并将超纯水作为阴性对照；

2）配制PCR反应体系，每个样品20 µl体系；

组成成分               体积

2X SYBRGreen缓冲液                         10µL

引物混合物                                         1µL

超纯水                                                7µL

病毒样品或标准品                          2 µL(相当于加入1μL初始病毒样品)

样品应按下表准备：

 

3）进行PCR反应；

4）病毒颗粒数的计算：病毒颗粒数(VP/mL) = 与标准品相对值×1000 。

（四）腺病毒感染目的细胞

进行腺病毒感染实验时可使用完全培养液（培养目的细胞用）稀释。培养液中的血清、双抗或其他营养因子不会影响腺病毒的感染效率。

以24 孔培养板为例，进行HEK293细胞的感染实验操作步骤如下：

注意事项：实验前请按照不同的MOI 设置不同的感染孔，并根据MOI 和细胞数量计算所需要的病毒量。

1. 第一天细胞的准备

在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3-5×10⁴个HEK 293细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养液体积为300mL(进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右)。

2. 第二天病毒的准备

根据实验的实际情况和MOI 值，用培养液准确稀释腺病毒原液。

注意事项：可使用PBS缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。

3. 第二天感染目的细胞

在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液，混匀后放于二氧化碳培养箱（37 ℃、5% CO₂）孵育过夜。

注意事项：

1）感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，请务必保证加入病毒前，细胞处于良好的生长状态。

2）若病毒对目的细胞的感染效率较低，可通过提高MOI  值提高病毒的感染效率，也可在培养液中加入助感染试剂ADV-HR（详见附录1、附录4、附录5）来提高病毒的感染效率。

4. 第二天更换培养液

病毒感染细胞12小时后，更换培养液。

注意事项：换液具体时间需视细胞状态而定。如果腺病毒对细胞有明显毒性作用，影响细胞生长状态，最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液后继续培养。

5. 第三天感染效率检测

感染24小时后，可利用倒置荧光显微镜观察病毒感染目的细胞的效率。如选择的腺病毒载体不带有荧光标记，可以通过Q-PCR(定量PCR)检测目的基因的表达来评估感染效率。

六．附录

附录1.   常见问题解答

1. 从维真生物购买的人类ORF开放阅读框克隆的序列与参考序列完全一致吗？

克隆序列并不总是与RefSeq的公布的序列完全一致。维真生物的大部分人类ORF克隆的序列与NCBI公布的参考序列完全匹配，但部分克隆的序列含有SNP单核苷酸多态性，存在短序列的插入或缺失。维真生物人类ORF的亚克隆模板来自哺乳动物MGC库或cDNA文库，序列的差别反映了来自不同组织和不同个体的差异。

2. 维真生物所有的人类ORF克隆都已全长测序验证了吗？

是的。维真生物科技有限公司所有的人类ORF克隆都已通过全长序列测序。每个克隆首先用Sanger法对两端序列进行测序验证，然后通过NextGene二代测序方法对全长序列测序。每个克隆的测序结果已在我们的官方网站公布。维真克隆的序列与参考序列之间的差异也可在网站上查阅。提交您的订单前，我们强烈建议您下载我们的序列并比对差异。

3. 在什么情况下可以选用腺病毒载体作为将外源基因导入细胞的工具？

腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞。它适用于体内和体外基因传递，转染效率高，对外源基因瞬时表达量高。但相对于其他病毒载体系统，腺病毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性。

您应考虑以下几点：

1. 外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达？

2. 需转染分裂细胞还是非分裂的细胞？

3.对于靶细胞的潜在免疫原性是否有充分的了解？

4.病毒用来进行体内还是体外基因传递？

当有以下实验要求时，可以考虑使用腺病毒替代慢病毒：

1.       需缩短实验周期；

慢病毒感染效率约70%左右，不能直接进行后续实验，需筛选稳定细胞株，而筛选时间至少为两周。而腺病毒感染效率高，在很多细胞株中的效率可以达到99%，可直接进行后续实验，节约经济成本和时间成本。

2.       需进行动物实验；

用于动物实验的病毒需具有较高的滴度，才能达到使用最小体积注射的目的。目前，慢病毒能达到的最高有效滴度通常在10⁸TU/mL左右，如选用慢病毒，约需1mL 病毒注射体积。大体积的液体量对于动物是有害的，尤其是注射脑部。腺病毒的滴度可达10¹¹PFU/mL，应用于动物实验时，每只小鼠只需要1μL，而每只大鼠10μL既可。不仅如此，腺病毒可进行扩增纯化，从而避免重新包装，以节约经济成本和时间成本。

请参阅下面的表格，选择适合您的病毒载体。

 

 

4. 病毒滴度如何测定?

测定腺病毒的滴度有三种常用的方法：（1）空斑形成实验（2）孔稀释法（3）BAC法

空斑形成实验是一种检测有感染能力的病毒（PFU）的生物学方法。通常是用一系列病毒稀释液感染单层HEK293细胞，病毒在感染的细胞中繁殖，最终导致细胞毒性效应并被释放出来。释放的病毒将感染邻近的细胞，这整个过程将被不断重复，最终导致空斑的形成。为了阻止病毒扩散并形成新的空斑，在完成最初感染后，要将一层0.5%的琼脂铺在细胞表面上。病毒滴度（PFU/mL）可通过统计空斑数目获得。空斑的形成需3周时间。

孔稀释法是在Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为：每种病毒准备8个1.5mL Eppendorf管，每管加入297μL完全培养液，向第一个管中加入33µL病毒原液，混匀后，吸取30µL加入第二个管混匀。依此类推，做8个稀释度（10~10^-6）。弃去96孔板中原有的培养液，每个稀释度重复3个孔，每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。感染24小时后用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内的荧光细胞数，计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数，假设为A（倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数）和B（倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数）。腺病毒病毒滴度计算公式：腺病毒滴度 (PFU/mL) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μL）

BAC法是检测蛋白浓度，仅适用于纯化后的腺病毒。通常1 ug蛋白=1X10⁹ VP。

5. 如何选择病毒感染细胞的最佳MOI值？

由于病毒用量过少会无法达到理想的感染效率，病毒用量过多会造成细胞毒性。建议感染目的细胞前，根据维真生物为您提供的“腺病毒感染目的细胞预实验”来选择最佳腺病毒用量。

6. 如何确定目的细胞是否可被腺病毒感染？

建议使用前查询相关文献。通常腺病毒可以感染哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不能被感染，例如一些淋巴细胞系。为确保目的细胞可被腺病毒感染，建议使用有荧光标记的腺病毒对目的细胞进行预实验（详见“腺病毒感染目的细胞预实验”）。

7. 腺病毒需要纯化吗？

如果病毒被用于体外细胞实验，不需要进行纯化。由于未纯化病毒液中含有的细胞碎片和少量培养基成分易诱导显著的免疫学反应，用于体内实验或动物实验的病毒需进行纯化，从而除去有缺陷的病毒颗粒和其他培养基中的成分。

8. 什么是RCAs？如何检测 RCAs?

HEK293细胞中存在与血清5型腺病毒相同的序列，重组腺病毒与293细胞的重叠序列交叉重组，可产生复制能力的腺病毒（Replication Competent Adenoviruses：RCAs），RCAs发生的几率较小。

RCA可使用非辅助细胞，如HeLa进行检测。将梯度稀释的病毒液感染HeLa细胞，并培养8天。8天后，若没有空斑产生，重组的腺病毒则不是有复制能力的腺病毒。

9. 怎样提高腺病毒的感染效率？

细胞良好的生长状态和感染时适合的MOI值是达到高感染效率的保证，而且腺病毒是通过细胞的表面受体CAR和细胞接触后，侵染细胞的。所以如果目的细胞的CAR受体少，病毒的感染效率就会低。一般情况下，可以通过提高感染时的MOI值来提高病毒的感染效率，必要时可在感染时加入助感染试剂ADV-HR来提高腺病毒的感染效率。

10.    助感染试剂ADV-HR的使用浓度和使用方法是什么？

助感染试剂ADV-HR能够显著提高腺病毒的感染效率。但较高浓度的ADV-HR具有细胞毒性，影响细胞状态和感染效率。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实验。我们在HEK293中的实验表明（详见附录5），当ADV-HR使用浓度小于等于1.0×10^-2mg/mL时，细胞状态良好。

此外，对于较难感染的细胞系（如CNE2）建议使用“孵育法”（即附录4提供的方法），即将助感染试剂、腺病毒和一定数量的细胞悬液加至1.5mL Eppendorf管中，轻轻混匀，置于37℃培养箱中孵育0.5至1小时后转至培养皿中培养；对于较易感染的细胞系（如HepG2）建议使用“直接加入法”，即在感染时，直接将助感染试剂、腺病毒滴加至培养皿中。建议您针对目的细胞的具体情况，选择合适的感染方法。

附录2.   维真腺病毒感染HEK293细胞案例

附录3.   维真腺病毒滴度测定案例

 

 

附录4.  助感染试剂ADV-HR在维真腺病毒感染中的作用（孵育法）

 

操作步骤：

1、准备细胞：

贴壁细胞消化后离心、悬浮细胞直接离心，弃去上清，用无血清培养液调整细胞浓度至10⁶cell/88ul，备用。

2、在1.5mL EP管中建立感染体系如下所示：

①助感染试剂（10x）10uL

②病毒     (10¹¹VP/mL)      2uL

③细胞悬液（10⁶cell/88ul）    88uL         

用移液器轻轻吹打混匀，于37℃细胞培养箱中孵育0.5~1h。

3、用移液器将感染体系中的细胞轻轻悬起，转移至预先加有培养液的6孔板中培养，建议加入细胞培养液体积为2.5mL/孔。

4、若为含有GFP标签的载体，可于感染24h后不同时间段观察荧光表达。

                                  

附录5.  摸索助感染试剂ADV-HR的使用极值实验

 

实验规模：96孔板(定容至100μL)

ADV-HR浓度：1mg/mL

说明：

1.       ADV-HR终浓度在0至1.0×10-2mg/mL之间对细胞状态无影响；

2.       ADV-HR终浓度在2.5×10^-2mg/mL时细胞生长缓慢；

3.       ADV-HR终浓度在5.0×10^-2至1.0×10^-1mg/mL时细胞呈现明显破碎， 2.5×10^-1至5.0×10^-1mg/mL时细胞皱缩甚至停止生长。

建议：

1.      请在使用ADV-HR前于目的细胞中进行浓度梯度预实验；

2.      建议ADV-HR的使用浓度不超过2.5×10^-2mg/mL。

附录6.  维真腺病毒感染HepG2、A549和Hela细胞的参考用量

因腺病毒种类、实验条件、细胞状态、实验人员熟练程度等的不同，以下MOI仅供参考。

务必于实验前进行MOI摸索预实验。

腺病毒滴度：3.7×10¹²VP/mL   

感染后24及120小时拍照

注：0.1μL病毒体积为梯度稀释后获得，并非使用移液器直接吸取。

实验规模	每孔Vigene腺病毒量 （联合ADV-HR的使用时）	每孔培养基定量
96孔板	0.1μL	100μL
48孔板	0.4μL	200μL
24孔板	1μL	500μL
6孔板	5μL	2mL

附录7.维真自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图