1:无Ct值出现
a. 检测荧光信号的步骤有误:看设置时是否有读取荧光信号这一步;
b. 反复冻融次数过多或储存条件不合适造成引物降解:更换引物;
c. 模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;
d. 模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况;
2:Ct值出现过早(Ct<10)
模板浓度过高:需将模板稀释;
3:Ct值出现过晚(Ct>38)
a. 扩增效率低:反应条件不够优化。需设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等;
b. 模板量不足:适当增加模板量;
c. PCR产物太长:一般采用80~150 bp的产物长度,最好不要超过200bp以免影响qPCR反应的扩增效率;
4:同一模板复孔间Ct重复性不好
(相差>0.5)
a. 试剂混合不均:加样前将模板及配好的混合试剂充分混匀后加入至上样孔;
b. 加样误差:加样时要时刻注意确认枪的刻度,同时应注意枪尖是否有液体残余;
5:扩增效率低
a. 试剂:反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解;
b. 反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法;
c. 反应体系中有 PCR 反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响;
6:扩增曲线异常,并非标准的S型曲线
a. 荧光染料的降解:更换新的荧光染料;
b. 模板的浓度太高或者降解:模板浓度太高可能会对PCR反应有所抑制;
7:熔解曲线有双峰
a. 存在非特异性扩增:建议提高退火温度,消除非特异性扩增;
b. 引物特异性不好:重新设计特异性好的引物;
c. 待检目的基因mRNA水平含量很低:更换基因或模板;
8:标准曲线线性关系不佳
a. 加样存在误差:使得标准品不呈梯度,因此加样前要充分混匀;
b. 标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品;
c. 引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针;
d. 模板中存在抑制物:如酒精等;
9:阴性对照有荧光信号
a. 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现;
b. 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比;
c. PCR其他试剂有污染:实验过程中应避免DNA的引入。
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
关 于 维 真 |
|
质 粒 现 货 |
|
病 毒 现 货 |
|
服 务 项 目 |
|
技 术 支 持 |
|||
|
|
维真腺相关病毒技术专题 |
||||||||||
|
|
|
||||||||||
|
|
|||||||||||
|
||||||||||||
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
![]() |
|||||||||
|
|
|
||||||||||
关键词: |
腺病毒 | 慢病毒 | 腺相关病毒 | 腺病毒现货 | 腺病毒包装 | 慢病毒包装 | 腺相关病毒包装 | 载体构建 | 质粒 | 细胞自噬 | shRNA | sgRNA | AAV包装 | 维真生物 |