1:无Ct值出现

a. 检测荧光信号的步骤有误：看设置时是否有读取荧光信号这一步；

b. 反复冻融次数过多或储存条件不合适造成引物降解:更换引物；

c. 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

d. 模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；

2:Ct值出现过早(Ct<10)

模板浓度过高：需将模板稀释；

3:Ct值出现过晚（Ct>38）

a. 扩增效率低：反应条件不够优化。需设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等；

b. 模板量不足：适当增加模板量；

c. PCR产物太长：一般采用80～150 bp的产物长度，最好不要超过200bp以免影响qPCR反应的扩增效率；

4:同一模板复孔间Ct重复性不好
（相差>0.5）

a. 试剂混合不均：加样前将模板及配好的混合试剂充分混匀后加入至上样孔；

b. 加样误差：加样时要时刻注意确认枪的刻度，同时应注意枪尖是否有液体残余；

5:扩增效率低

a. 试剂：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；

b. 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；

c. 反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响；

6:扩增曲线异常，并非标准的S型曲线

a. 荧光染料的降解：更换新的荧光染料；

b. 模板的浓度太高或者降解：模板浓度太高可能会对PCR反应有所抑制；

7:熔解曲线有双峰

a. 存在非特异性扩增：建议提高退火温度，消除非特异性扩增；

b. 引物特异性不好：重新设计特异性好的引物；

c. 待检目的基因mRNA水平含量很低：更换基因或模板；

8:标准曲线线性关系不佳

a. 加样存在误差：使得标准品不呈梯度,因此加样前要充分混匀；

b. 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；

c. 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针；

d. 模板中存在抑制物：如酒精等；

9:阴性对照有荧光信号

a. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；

b. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；

c. PCR其他试剂有污染：实验过程中应避免DNA的引入。