一、无信号或信号弱

1

抗原量不足

适当增加蛋白上样量，或更换检测样本

2

抗体不足或孵育时间短

降低抗体的稀释度，延长抗体孵育时间

3

一抗、二抗不匹配

核实抗体适用的物种信息

4

抗体保存不当或放置时间过长

更换新抗体

5

电极插反，转膜失败

重新操作；

6

蛋白分子量较小(<10KD)，转膜时间过长

减少转膜时间，使用小孔径膜

7

蛋白分子量较大而转膜时间不足

适当延长转膜时间

8

洗膜过度

降低洗膜强度（如时间/次数/温度）

9

滤纸、胶、膜之间有气泡

配胶与转膜时小心操作，防止气泡产生

10

其他

二、背景高

1

一抗浓度过高

调整抗体稀释比

2

封闭不充分

延长封闭时间或优化封闭条件包括封闭液，避免多张膜重叠

3

抗体孵育温度过高：

最好调整为4℃环境下孵育

4

洗膜不充分

提高洗膜的次数和时间等

5

膜干燥：

操作过程中应始终保持膜的湿润（干转除外）

6

显色时间过长，胶片曝光时间过长

摸索合适的显色曝光时间

7

膜没有均匀浸湿：

转膜前应将膜完全浸湿

8

膜或者缓冲液污染：

全程佩戴手套；更换新鲜转膜缓冲液

9

其他

三、出现非特异性条带

1

抗体特异性较差

选取效价高的一抗

2

蛋白上样量过大

酌情减少上样量

3

抗体浓度过高，孵育时间过长

降低抗体的稀释度和孵育时间

4

洗膜不充分

适当增加洗膜的时间和次数

5

封闭效果差

更换封闭液，适当延长封闭时间

6

二抗出现非特异性结合

设立不加一抗只加二抗的平行对照

7

其他

四、其他注意事项

1

胶板、玻璃等需洗刷干净；

2

倒胶前两块玻璃板底部需对齐，防止漏胶；

3

严格把控AP和TEMED的加入量

4

配胶时加入试剂后需摇匀，使各组分充分混合，防止胶块聚合不均

5

其他