一、细胞培养的概念
细胞培养技术也叫细胞克隆技术,是指将活体组织或细胞从试验动物体内取出,放在模拟体内生存环境的体外环境中(无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件),使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养技术在生物、医学研究等领域都有着广泛的应用。
二、体外培养细胞的分型
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养,一般持续1-4周;原代培养形成的单层细胞汇合以后,需要进行分离培养,此过程称为传代培养。
贴附型细胞主要分为以下几个类型:成纤维细胞型;上皮型细胞;游走细胞型;多型细胞型。悬浮型的则见于少数特殊的细胞,如某些类型的癌细胞及白血病细胞等。
三、细胞培养的条件
在细胞培养过程中,应根据离体细胞的特点和培养条件,提供满足其生长和发育的一些基本生理条件:
1、必须保证在无菌条件下进行。细胞感染微生物后,会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞,甚至死亡。
2、需要提供适宜的温度和CO2浓度。一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37℃,鱼类的温度要低一些。温度过高或过低,均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。在细胞培养过程中需要提供一定量的气体(O2和CO2)。CO2具有调节pH和缓冲的作用,一般提供5% CO2。
3、细胞离体培养技术的关键是细胞培养基。细胞培养基中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质,如提供能量的物质(N源、C源)、代谢调节控制的物质(无机盐、维生素、激素)。理想的细胞培养液可以同时满足细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质等的全部需要。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4,在此范围细胞生长活跃,增殖速度快,如果PH过低或过高,细胞将因为细胞膜受损而死亡。
四、细胞培养的一般过程
1、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,准备工作中某一环节的疏忽均可导致细胞培养的失败。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试等。
2、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器皿中,这一过程称为取材(如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程)。
3、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示,由所养细胞决定具体量)接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后,立即放入恒温培养箱中,正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否正常(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
注意:培养细胞的密度要根据细胞的特性及传代的时间等来定,无论传代与否,培养基最好不要超过2天就要更换一次。
4、冻存及复苏 为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程如下:
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取出冻存管后,立即放入37℃水浴锅中,使之在一分钟内迅速融解,然后将细胞转入培养器皿中进行培养。复苏过程如下:
注:冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
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