AAV和慢病毒载体是最近几种获批基因疗法的基础。基因编辑技术处于转化和临床初期阶段，但预计将发挥越来越大的作用。（图片来源：Science）

本文转载自“药明康德”。

基因疗法的历史

在四十五年前，基因疗法界的领军人物Theodore Friedmann博士曾设想过通过基因治疗来改善由单个基因引起的遗传性疾病。基因治疗可能具有治疗更方便、效果更持久的临床益处。与那些旨在提供某类蛋白质的疗法相比，对患者体内的细胞进行基因疗法处理，让其持续自动制造这些所需蛋白，就能避免患者重复输注药物的需要。比如说，对造血干细胞（HSC）进行基因工程改造让其制造内源性的凝血因子，从理论上说能持续缓解血友病症状，而不需使用酶或输血治疗。

在最初，基因治疗是被设计用来治疗先天性的遗传疾病，但近年来的科学发展让基因治疗在后天获得的疾病领域也有用武之地。近期最好的例子是用基因工程改造，治疗癌症的CAR-T细胞，只需一剂，就能在患者体内产生持久的反应，长期杀灭癌细胞。

基因疗法从概念转化为临床试验是在20世纪90年代初期，但第一代基因疗法的结果总是让人处于从希望到失望的循环，结果显示，那些基因疗法要么缺乏实际的临床益处，要么会产生意外的副作用，有时候甚至导致接受治疗的患者死亡。在1996年，美国国立卫生研究院（NIH）的顾问委员会对这些试验进行了评估，他们认为这些试验的结果令人失望，是因为科学界当时对病毒载体、目标细胞和组织以及疾病的认识还不足。于是，该委员会建议研究者重返实验室，对基因疗法继续进行钻研。

之后，研究者发现了新的载体，对目标细胞也有了更深入的理解，从而引发了在20世纪90年代末期和21世纪初期出现的第二代基因疗法的临床试验风潮。这些试验显示，基因疗法能在目标组织中造成持续的修改效果，甚至在一些试验中展露临床益处。但是，高效能的转基因也导致了高毒性的副作用，比如有插入导致的遗传毒性，破坏免疫细胞、以及与载体有关的免疫反应等等。于是，基因治疗仍待进一步完善。

在最近的十来年里，有关基因治疗的研究进一步深化，对疗法安全性的改进和对基因转移效率的改善等等，让基因疗法有了巨大的临床进展。在美国和世界各地，已有几种基因疗法和基于基因编辑的疗法获得了FDA批准，另外还有多种基因疗法获得了FDA颁布的“突破性疗法”的称号。下面将着重讨论这些成功的疗法，以及有望在近期转化为基因治疗的相关技术。

基因工程技术：从病毒载体到基因组编辑

基因疗法所涉及的基因工程技术主要有三种，包括病毒载体、基因编辑和细胞改造。其一是将正确的基因通过载体送入目标细胞让其发挥作用；其二是直接通过基因编辑技术修复目标细胞的缺陷基因；其三则是从患者体内提取细胞在体外进行修改，然后再重新输回患者体内发挥作用。它们各有优劣，适用范围和操作难度也各不相同。

病毒载体技术

对于第一种技术，研究者用来传递基因的载体多是病毒类载体，因为它们能将基因整合进宿主基因组。经过基因改造后，这些作为载体的病毒具有复制缺陷，无法增殖，达到能将基因转移到人体细胞的基因组中而无毒性的效果。目前最具临床潜力的是逆转录病毒（retroviruses）载体和腺相关病毒（adeno-associated viruses，简称AAV）载体。

HSC基因疗法的历史性概览（图片来源：Science）

在20世纪80-90年代开发出的γ-逆转录病毒载体（γ-retroviral vectors）是首个被证明能将基因传递给能重新生长的HSC的载体。它和C型逆转录病毒（C-type retroviruses）曾被用于第一代基因治疗临床试验，旨在将缺陷基因的正常拷贝传递到患者的HSC或T细胞中。后来研发的慢病毒（lentiviruses）载体和泡沫病毒（spumaviruses）载体将这类技术应用范围进一步扩大：慢病毒载体能把基因转移到非分裂期细胞中，而不影响处于G0的细胞，它还可以携带更大、更复杂的基因盒。慢病毒和泡沫病毒载体的另一个优点是它们会优先整合进基因的编码区域，而不像γ-逆转录病毒载体那样，会整合进入基因的5'非翻译区，从而降低在HSC中致癌的潜在风险。 因此，慢病毒载体是目前大多数HSC编辑的首选工具，但是γ-逆转录病毒载体仍然在一些T细胞基因工程和某些基因疗法中有用武之地。

AAV基因治疗血友病的历史性概览（图片来源：Science）

AAV载体则是从非致病、无病毒包膜、天然具有复制缺陷的细小病毒（parvovirus）发展而来。野生型AAV需要另一个病毒如腺病毒（adenovirus）或疱疹病毒（herpevirus）的帮助进行复制。在基因疗法中，AAV的所有病毒编码序列都被想要表达的基因盒所取代，从而不会造成病毒感染。 AAV载体的一个限制是不能容纳超过5.0kb的DNA，相比之下，γ-逆转录病毒或慢病毒载体最多可以容纳8kb。 而且，AAV载体主要是非整合性的，它们转移的DNA会作为稳定的附加体（episome）存在，这能减少与整合进宿主基因相关的风险，但也限制了它们在有丝分裂后细胞中的长期效果。在20世纪90年代，有试验显示了AAV载体在动物各种目标组织中进行基因传递的能力，其中包括肝脏、视网膜、心肌和中枢神经系统等。临床试验测试了AAV载体在肌肉注射和静脉注射给药时的效果，结果显示，利用AAV载体递送的转基因在合适的情况下（比如短期用免疫抑制药物）能在接受者体内长期存在，递送到视网膜色素上皮细胞中的转基因效果能长达三年。这些进展为将基因递送至大脑和肌肉奠下了基石。虽然AAV的安全性较佳，但其疗效受到剂量限制以及对AAV的免疫反应影响。

基因编辑技术

与只能添加基因的病毒载体相比，基因编辑技术可以达到添加基因、消除基因、矫正基因以及其他多种基因组编辑的效果。基因编辑既可以在体外细胞进行，也可以将基因编辑工具递送到体内进行原位基因组编辑。要对于目标基因进行编辑，第一步是进行受核酸酶（nucleus）介导的双链断裂，引发细胞中的DNA重组和修复。非同源末端链接（NHEJ）性质的重组能够有效地插入、删除或灭活某基因。而同源导向修复（HDR）则能在有正确的DNA模板存在的情况下，用于制造正确的对应序列，达到修复基因的目的。早期的基因编辑手段依赖于特异性锌指核酸酶（ZFNs）或者大范围核酸酶（meganucleases），对于每个待编辑的目标DNA区域都要重新设计特定序列，在可操作性和易用性上不尽如人意而限制了普及性。在2009年，基于名为TALEs细菌的蛋白开发出的转录激活因子样效应物核酸酶技术（TALENs），能有效切割DNA的任何目标序列，让基因编辑技术大步前进，但这项技术仍然需要对每个DNA目标序列设计特定的核酸酶，因而有一定的局限性。

到了2012年，研究者发现了一种细菌防御机制，包括规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）及相关核酸内切酶（Cas）的CRISPR/Cas9系统在有引导RNA（gRNA）的存在下，能方便准确地切割DNA，这导致了CRISPR/Cas9基因编辑技术横空出世，并被迅速应用到各类真核动物细胞，大大简化了基因编辑的工作量并且降低了花费。通过CRISPR/Cas9系统可以增添、敲除、开启或关闭基因，对任何哺乳动物细胞的基因进行替换和改造，从而改善缺陷基因的功能或者遏制致病基因，甚至能通过敲除细胞表面蛋白达到阻碍病毒入侵人体细胞的目的，或者通过编辑免疫细胞为器官移植患者降低免疫排斥反应等等，在诸多疾病治疗领域大有可为。目前研究者正在改善该技术的脱靶效应和安全性，以便让其为更广大的患者带来福音。

跟病毒载体相比，基因编辑技术能较精确地编辑基因组，克服病毒载体插入位置较随机的问题，从而避免随机整合可能带来的原癌基因激活和抑癌基因失活等副作用，并且，通过基因编辑引入的基因能受到目标组织内源性启动子的控制，让基因表达更具生理相关性。但是，将基因编辑所需的全部组件递送至目标组织细胞内仍有一定难度。如果只需要NHEJ编辑，那么用非整合性病毒载体即可达到目的，但如果需要进行有DNA模板的HDR编辑，那么目前的技术仍需要优化，才有望在一些特定细胞中达到可接受的效果。

细胞工程

近年来在癌症研究学界声名鹊起的免疫疗法，其中之一就是基于工程化T细胞的CAR-T基因疗法。CAR-T中的CAR是指工程化的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor），由一个来自免疫球蛋白分子或T细胞受体的抗原结合结构域和介导细胞内信号传导域融合，从而激活和增强T细胞的功能和持久性。CAR-T 治疗首先要从患者体内分离T细胞，在体外将工程化的CARs传送到T细胞中，产生抗原特异性的T细胞，让其能识别和杀灭癌细胞，经由体外扩增后再次注入患者体内，以此达到消灭癌细胞的效果。理论上，CAR-T可以达到一劳永逸的治愈效果。在2017年一年内，美国FDA就批准了2个CAR-T疗法，用于治疗难治性急性淋巴性白血病（ALL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。目前在这领域的研究旨在加快患者个体化CAR-T的制备过程，扩大CAR-T的适用范围到骨髓瘤和实体瘤，以及降低治疗时的危险性和副作用。

CAR-T细胞疗法的历史性概览（图片来源：Science）

CAR-T疗法能针对的不仅仅是癌症。与生理存在的抗原受体相比，CARs可被设计来识别蛋白质、碳水化合物糖脂以及HLA-肽复合物等等，所以在将来还有潜力治疗以T细胞为基础的其他疾病，比如自身免疫性疾病和艾滋病等等。

总结

基因疗法可算是有史以来最复杂和多样化的药物疗法。从研究性学术环境中起步，通过与生物技术公司和制药企业的合作转变为工业化的药物开发途径。近年间，基因编辑技术基础理论方面的进展、多个临床试验的成熟结果以及监管方的批准，显示了基因治疗进入了一个兼具安全性和有效性的时代。但这个领域中仍然存有许多挑战，包括处理整合性基因载体的遗传毒性，降低基因编辑的脱靶效应，和提高基因递送和编辑的效率，让其达到有临床益处的水平等等。种种结果显示，基因疗法的潜力极大，有望在不远的将来解决一些至今让医疗界素手无策的顽疾，为人类健康带来持久的益处。

“来源：生物探索”