细胞培养那点事儿（技巧篇）

       在细胞培养实验中，大家总会遇到各种形形色色的问题，比如说不知道该如何操作，该注意什么问题，那么现在，我们一起来学习下在细胞培养中你应当知道的实验小技巧。

一、无菌意识要强

       细胞培养中最重要的就是要保证无菌条件，这是培养成功的大前提。主要包括，器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的消毒与杀菌等。

1、实验进行前后，超净台以紫外灯至少照射30分钟灭菌，以70%乙醇擦拭无菌操作台，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，再开始实验操作。

2、确保每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%乙醇擦拭无菌操作台面。

3、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以70%乙醇擦拭后再带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域，一般勿在边缘区域操作。

4、小心取用无菌实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

5、为避免污染，尽量不要和别人共用试剂耗材，最好自己准备一套。

6、水浴锅中添加灭菌水，并注意经常更换。

二、正确选择、保存血清和培养基

       在细胞培养中，特别需要注意的是，血清和培养基的选择和处理非常重要！

       目前用于细胞培养的血清主要是牛血清，如小牛血清和胎牛血清等，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等，建议您根据所培养的细胞选择适合的血清。解冻血清时需采用逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，在4℃冰箱全溶后再根据实验需求进行分装保存。需要长期保存的血清必须储存于-20℃或-80℃低温冰箱中。在4℃冰箱中保存时间请勿超过1个月，且最好不要血将清置于室温环境中，室温放置太久血清会变得浑浊，且血清营养成分可能损坏。

       注意：热灭活会使血清沉淀物增多，若无必要可省略此步，若必须热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。

       另外，不同的细胞可能培养基不同，细胞培养时需选择适合的培养基。针对不同的细胞培养的需求，有高糖培养基和低糖培养基，特殊培养基和干粉培养基等。细胞培养基的储存条件是2℃-8℃，一般置于4℃冰箱保存即可。培养基容易氧化，PH升高，因此打开后最好不要长时间放置不用，此外，还需要具体情况决定添加抗生素和其他细胞培养添加剂等。

三、试剂的分装保存

       为保证试剂能保持最佳的营养和活性，血清、培养基、胰酶等试剂最好小剂量分装保存，同时，降低污染的风险。

四、培养注意事项

1、根据每种细胞自身的特点，合理把握吹打的力度、胰酶消化时间、细胞传代换液时间等；

2、动作要快，细胞暴露在空气中的时间越少越好；

3、冻存复苏的原则：慢冻快融；

4、冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基；

5、养成定期保种的好习惯；