细胞培养那点事儿（基础篇）

一、细胞培养的概念

       细胞培养技术也叫细胞克隆技术，是指将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境中（无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件），使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养技术在生物、医学研究等领域都有着广泛的应用。

二、体外培养细胞的分型

       机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养，一般持续1-4周；原代培养形成的单层细胞汇合以后,需要进行分离培养，此过程称为传代培养。

       贴附型细胞主要分为以下几个类型：成纤维细胞型；上皮型细胞；游走细胞型；多型细胞型。悬浮型的则见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞等。

三、细胞培养的条件

       在细胞培养过程中，应根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件：

1、必须保证在无菌条件下进行。细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。

2、需要提供适宜的温度和CO2浓度。一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O₂和CO₂）。CO₂具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO₂。

3、细胞离体培养技术的关键是细胞培养基。细胞培养基中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质，如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。理想的细胞培养液可以同时满足细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质等的全部需要。动物细胞适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果PH过低或过高，细胞将因为细胞膜受损而死亡。

四、细胞培养的一般过程

1、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽均可导致细胞培养的失败。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。

2、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材（如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程）。

3、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示，由所养细胞决定具体量）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入恒温培养箱中，正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否正常（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

注意：培养细胞的密度要根据细胞的特性及传代的时间等来定，无论传代与否，培养基不要超过2天就要更换一次。

4、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度-196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程如下：

       复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水浴锅中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。复苏过程如下：

注：冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。