维真腺相关病毒在肾病研究中的应用

研究背景

慢性肾脏病导致的肾纤维化是终末期肾衰竭（尿毒症）的主要原因。研究表明，TGF-β1（转化生长因子β1）信号通路在肾间质纤维化过程中起到重要作用，在TGF-β刺激下，Smad3（信号转运蛋白）的磷酸化是整个TGF-β/Smad3通路活化的关键环节。过去的研究主要集中在关键蛋白编码基因上，即传统的关键基因突变导致其编码的蛋白发生改变进而引起生物学功能的异常。然而，随着分子生物学机制研究的发展，人们发现表观遗传学在肾脏间质纤维化的发展中同样起着重要作用。

研究思路

研究者用TGF-β进行诱导，并通过高通量筛选技术，观察肾小管上皮细胞中差异表达的长链非编码RNA的表达，发现在TGF-β刺激下lnc-TSI的表达显著增加。在生物学功能上，研究者发现Inc-TSI通过特异性抑制Smad3的磷酸化负向调控TGF-β/Smad3信号通路。分子机制研究发现，Inc-TSI可以通过结合Smad3的MH2结构域而阻止TGFβ I型受体和Smad3的结合。动物实验表明，通过腺相关病毒AAV9实现人源基因lnc-TSI在小鼠肾脏中的过表达从而有效防治小鼠肾纤维化模型的发生发展。在慢性肾脏病人群的队列研究中发现，在患者的肾脏活检组织中，lnc-TSI的表达水平与肾间质纤维化的严重程度呈负相关。在长期随访、接受重复肾活检的慢性肾脏病患者中，研究者发现首次肾活检时肾脏lnc-TSI表达较低的患者，4年后肾纤维化和肾功能减退较lnc-TSI表达较高者更为严重。

病毒产品及使用方法

实验结果分析

研究者采用单侧输尿管结扎（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）的方法，于术前一周进行小鼠肾静脉原位注射。用生理盐水将10μL腺相关病毒（AAV9-TSI，1×10E14 vg/mL）稀释至100μL体积，每只小鼠使用100μL病毒稀释液，于造模一周后处死小鼠。具体操作如下：使用动脉夹夹闭小鼠的肾静脉，并用31G的针头注射进入肾静脉，保持夹闭15分钟后松开。

图1、 lnc-TSI在肾脏组织中的过表达。 Northern blot实验证明，这种感染方法可以使lnc-TSI主要表达于肾脏中（1A）。同时，使用RNA原位杂交发现，病毒感染使lnc-TSI主要表达于肾皮质的肾小管上皮细胞中（1B），皮质中被感染成功的细胞百分比约为40-60%（1C&1D）。

图2、肾脏组织中检测lnc-TSI的表达和UUO所致的肾间质纤维化病变程度。Northern blot结果显示，通过注射腺相关病毒AAV9-TSI可以成功在小鼠肾脏中表达lnc-TSI（2 B）。并且，在小鼠肾脏中特异过表达lnc-TSI可以有效减轻单侧输尿管结扎（UUO）所致的肾间质纤维化（2 C），表现为肾间质纤维化评分（TIF index）降低（2D）和肾小管中pSmad3蛋白的表达下降（2 E）。