维真AAV病毒在高血压脑出血中的应用

研究背景

高血压脑出血是非常严重的一类高血压并发症，已成为人类重大健康负担。尽快明确高血压脑出血发病机制以及干预中年人脑出血风险已刻不容缓。但目前针对高血压脑出血相关发病机制的研究还很不成熟，并且没有针对预防脑出血的药物投入临床应用。中国医学科学院阜外医院陈敬洲教授团队承担题为“豆纹动脉神经复合体”区易发脑出血的遗传、环境危险因素及预警生物标志研究”的973研究项目，主要致力于高血压脑出血的机制研究。

通过GEO数据库，该团队将人外周血管平滑肌细胞和内皮细胞外显子芯片结果（GSE15805）与人脑血管平滑肌细胞和内皮细胞外显子芯片结果（GSE19090）进行交叉比对后发现，包括Plod3（编码赖氨酸羟化酶-3，LH3）在内的多种基因在脑血管平滑肌的表达水平较颅外平滑肌显著降低，且在脑血管平滑肌中尤为明显，进一步通过网络通路分析发现该基因处于富集通路的关键节点位置，因此推测上述基因可能与高血压脑出血血管病变密切相关。（文章所用AAV9-LH3产品由维真生物提供）

路线设计

首先该团队构建了小鼠高血压脑出血模型，提取正常对照组及高血压脑出血组小鼠的脑血管RNA及蛋白，在mRNA水平及蛋白水平分别检测发现，在高血压脑出血时，小鼠脑血管Plod3显著下调。因此，该团队认为Plod3基因在高血压脑出血中可能发挥重要的保护作用。

部分成果展示

首先，研究者利用AAV9- Plod3转基因的病毒载体，通过立体定位注射的方法将病毒注射入小鼠侧脑室，4周后检测病毒感染情况及LH3在脑血管的表达情况。结果如图一所示，通过脑整体切片检测绿色荧光蛋白，提取脑血管蛋白进行Western Blot以及免疫荧光多重方法检测，确认了LH3基因确实在小鼠全脑中的过表达。立体定位注射分位置为前囟点后退0.2mm旁开1mm深2.7mm，注射病毒体积为2μL。

图一、AAV-LH3在小鼠全脑中的过表达

进而，采用血管紧张素（AngII）皮下埋泵的方法来构建小鼠高血压模型，但前期预实验结果提示，单纯AngII输注并不会引起小鼠高血压脑出血的发生，需要同时给予L-NAME，一种非选择性内皮一氧化氮合酶抑制剂联合应用，才能成功构建高血压脑出血模型。研究者进一步对各处理组高血压脑出血的发生情况进行了生存曲线描绘，结果显示高血压脑出血组小鼠28天时脑出血发生率为80%，Plod3过表达组脑出血发生率仅为30%，Plod3过表达组小鼠脑出血发生率显著下降，P<0.001。

图二、LH3 过度表达可以改善细胞外基质重塑和炎症过程

随后，该团队对Plod3抑制高血压脑出血的机制进行了深入探讨。通过对脑出血前分离的小鼠脑血管进行RNA-seq研究发现，Plod3主要通过抑制胶原重塑、减少血管周围炎症及抑制脑血管平滑肌细胞凋亡等多个层面减少高血压脑出血的发生风险及脑出血严重程度（如图二与图三所示）。

图三、过表达LH3能显著抑制血管平滑肌细胞的凋亡

本研究已被国际脑卒中研究领域的顶级主流期刊《Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism》接收，影响因子6.2。

图四、过表达LH3抑制脑出血模型

本课题的最亮眼的技术方法就是，利用维真生物公司构建的AAV9过表达Plod3，通过立体定位注射技术，突破血脑屏障的阻碍，在特定的脑区高表达Plod3以达到抑制高血压脑出血发生的目的。这为临床上高血压脑出血的预防手段提供了新的切入点，为生物医学转化找到了新的思路。