1. DREADDs技术

DREADDs（designer receptors exclusively activated by designer drugs，只由特定药物激活的受体），是一种基于G蛋白偶联受体所改造的化学遗传学平台，通过将不同的G蛋白偶联受体进行改造，让它能传递人工合成的蛋白质，修改后的受体只能由人工合成的特殊化合物来激活或者抑制，并激活相应的GPCR信号通路，从而引发细胞不同的兴奋性变

不同DREADDS对应的细胞内信号通路 （https://obsidiantx.com）

其中，由氯氮平N氧化物（clozapine-N-oxide，CNO）激活的DREADDs，能选择性地作用于不同的GPCR级联反应，包括激活Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin，其中Gq-DREADD和Gi-DREADD应用较为广泛。

 

 

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2. Gq-DREADD和Gi-DREADD

在正常生理条件下，人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型M3（hM3）能与内源性神经递质乙酰胆碱（Ach）结合，然后与Gq类的G蛋白偶联受体耦合，参与Gq类信号通路。人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型M4（hM4）与乙酰胆碱（Ach）结合后与Gi类的G蛋白偶联受体耦合发挥作用，参与Gi类信号通路。

hM3Dq 和hM4Di 的DREADD结构和G蛋白耦联特性 （Jürgen Wess et al, Trends Pharmacol Sci.2013）

然而，当将hM3与hM4上的两个保守位点A5.46G和Y3.33C突变后（上图中红色叉号表示），两者均不再与乙酰胆碱结合，而是能与外源添加的CNO高效结合。在CNO刺激下,HM3Dq起到激发神经元的作用,hM4Di则导致神经元的抑制。我们把突变之后的受体称之为hM3Dq和hM4Di。

 

 

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3. DREADDs研究步骤

1、选定合适的DREADDs受体； 2、通过转基因动物或病毒载体，将DREADD基因导入动物体内； 3、动物CNO给药（控制时间或剂量）； 4、DREADDs受体的有效性的检测和动物表型检测；

Jingwei Jiang,et al.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2017

 

 

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4.DREADDs应用与策略

DREADDs技术为神经科学家提供了强大的新工具，用于绘制大量中枢神经系统（CNS）功能背后的神经元回路，利用DREADDs技术，通过时间和空间控制的方式打开或关闭特定的神经元，例如，记忆形成、食物摄入调节和觉醒等。

 

DREADD基因靶向常见的两种策略为病毒注射和转基因动物模型。目前已开发出携带DREADD转基因的重组AAV载体，通过添加细胞特异性启动子，配合立体定位注射的方法，实现DREADD基因在不同组织细胞内的精准表达，利用CRE、FLP等技术，进一步实现基因的条件可控性表达，如当客户有CRE的转基因动物时，可直接利用携带DREADD转基因的DIO载体。此外，研究者还可利用一些特殊的AAV血清型等，实现病毒的逆向或跨神经突触的感染。

 

根据DREADDs的研究策略，维真开发出多种化学遗传学的载体，满足客户多样化的需求，下面是部分载体列表：

 

化学遗传学载体
hM3Dq	hM4Di
pAAV-GFAP-hM3D(Gq)-mcherry	pAAV-GFAP-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mcherry	pAAV-CaMKIIa-hM4D(Gi)-mCherry
pAAV-hsyn-hM3D(Gq)-mcherry	pAAV-hsyn-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mcherry	pAAV-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-hsyn-DIO-hM3D(Gq)-mcherry	pAAV-hsyn-DIO-hM4D(Gi)-mcherry
pAAV-CaMKIIa-DIO-hM3D(Gq)-mCherry	pAAV-CaMKIIa-DIO-hM4D(Gi)-mCherry
pAAV-TRE-hM3D(Gq)-mcherry	......