细胞自噬
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1. 什么是细胞自噬 细胞自噬（Autophagy）是指广泛存在于真核细胞内的一种高度保守的溶酶体依赖性的降解途径，是一种细胞自我保护机制。细胞自噬不同于细胞凋亡，它是细胞内的一种“自食（Self-eating）”现象，在能量匮乏、活性氧累积等应激条件下，细胞通过形成双层膜结构的自噬小体，包裹一部分胞内物质如长寿命蛋白和受损细胞器等，并将其运送到溶酶体进行降解和重新利用，从而实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新。 |
2. 细胞自噬分类
根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为大自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)三种主要方式，通常所说的自噬即指大自噬。根据自噬发生的条件，细胞自噬可以分为生理条件的基础型自噬和应激条件下的诱导型自噬。
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图1.细胞自噬的分类 （Giordano,et al.,2014） |
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3. 细胞自噬的意义
目前普遍认为自噬是一种防御和应激调控机制，生理性自噬是细胞的自我保护机制，能清除受损的细胞器如线粒体以及蛋白质聚合体，有益于细胞的生长发育，保护细胞防止代谢应激和氧化损伤，对维持细胞内稳态以及细胞产物的合成、降解和循环再利用具有重要作用；但自噬过度可能导致代谢应激、降解细胞成分、细胞死亡等，打破细胞生长和死亡间的平衡。
4. 主要自噬相关蛋白
自噬在进化过程中高度保守，自噬的整个过程中, 时刻都受到不同的自噬相关基因(autophagy-related gene, ATG)的调控，这些基因是自噬发生必不可少的分子，参与自噬发生的不同阶段，并且在物种间高度保守，下面列举哺乳动物和酵母中的主要自噬相关蛋白及功能，以及在自噬（大自噬）环节中的几种标志物。 其中，LC3（Atg8）、Beclin1（Atg6）、Atg5-Atg12、Atg16L等，是常用的自噬标志物，参与自噬的发生过程。
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图2.主要自噬相关蛋白 |
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5. 自噬标记物—LC3
LC3（light chain 3）是MAP1LC3 (microtubule-associated proteins light chain 3)，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物中的LC3与酵母中的自噬相关蛋白Apg8/Aut7/Atg8具有同源性。 LC3蛋白合成后在其羧基端被Atg4剪切，暴露甘氨酸残基，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II并定位于自噬体膜上（见图3）。哺乳动物中的LC3可分为三种： LC3A、LC3B和LC3C。 其中，LC3B作为LC3的一种，多被用作细胞自噬的分子标志。
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图3.LC3在自噬体形成中的作用 (Varuna C. Banduseela et al，Phyciological Genomics，2012) |
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6. 细胞自噬的过程
（1）自噬诱导：诸如辐射、饥饿、缺氧、细菌入侵、生长因子匮乏等多种因素均可诱导自噬发生；
（2）囊泡(吞噬泡)成核：细胞内质网膜、线粒体外膜、高尔基复合体膜或质膜等构成囊泡的双层或多层膜结构，30多种Atg(autophagy-related)蛋白在囊泡膜上顺序耦联组装成PAS；
（3）自噬体的成熟：PI3K核心复合体转变成 PtdIns(3)P(phosphatidylinositol 3-phosphate)，PtdIns(3)P作为“着陆台”，募集自噬蛋白进入到吞噬泡(phagophore)成核中心，在泛素化耦联系统的辅助下，Atg10、Atg7、Atg3、Atg8/LC3、Atg4和Atg12-Atg5-Atg16L1等最终被募集到PAS，参与囊泡膜延伸和自噬体(autophagosome)的成熟；
（4）自噬溶酶体的融合：自噬体通过酸化与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagolysosome)，降解其所包裹的内容物。
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图4.自噬过程模式图 (Suresh Subramani and Vivek Malhotra，EMBO Rep ,2013) |
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7. 维真自噬相关产品
（1）克隆产品：大量自噬相关基因
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基因名称 |
基因编号 |
产品货号 |
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alfy |
NM_014991 |
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ulk1 |
NM_003565 |
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sqstm1 |
NM_003900 |
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sqstm1 |
NM_001142298 |
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p150 |
NM_005407 |
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fip200 |
NM_014781 |
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p150 |
NM_012414 |
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ampk |
NM_017431 |
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ampk |
NM_002733 |
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ampk |
NM_006253 |
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ampk |
NM_006252 |
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ampk |
NM_206907 |
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pi3k |
NM_001142633 |
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p150 |
NM_014602 |
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pi3k |
NM_002649 |
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pi3k |
NM_005026 |
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pi3k |
NM_006219 |
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pi3k |
NM_006218 |
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pi3k |
NM_004570 |
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pi3k |
NM_002646 |
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nbr1 |
NM_031862 |
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mtor |
NM_004958 |
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lamp2 |
NM_001122606 |
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lamp2 |
NM_013995 |
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lamp1 |
NM_005561 |
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p150 |
NM_001206557 |
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rubicon |
NM_001145642 |
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p150 |
NM_014633 |
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p150 |
NM_005483 |
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bcl-2 |
NM_000633 |
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atg7 |
NM_006395 |
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atg7 |
NM_001136031 |
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atg7 |
NM_001144912 |
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atg5 |
NM_004849 |
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atg4 |
NM_032885 |
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atg4 |
NM_178221 |
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atg4 |
NM_013325 |
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atg4 |
NM_178326 |
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atg4 |
NM_052936 |
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atg4 |
NM_178270 |
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atg3 |
NM_022488 |
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atg16l1 |
NM_017974 |
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atg16l1 |
NM_198890 |
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atg16l1 |
NM_001190266 |
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atg16l1 |
NM_001190267 |
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atg16l1 |
NM_030803 |
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atg14 |
NM_014924 |
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atg13 |
NM_014741 |
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atg13 |
NM_001205122 |
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atg13 |
NM_001205120 |
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atg13 |
NM_001205119 |
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atg12 |
NM_004707 |
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atg10 |
NM_031482 |
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p150 |
NM_001150 |
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pras40 |
NM_032375 |
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p150 |
NM_007313 |
（2）病毒产品：自噬单双标腺病毒、慢病毒和腺相关病毒
mCherry-GFP-LC3B自噬双标系统的工作原理为：未发生自噬的细胞及含有自噬体的细胞中，由于mCherry与GFP共同表达，细胞呈现黄色荧光。当自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP荧光淬灭，而mCherry不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，红色荧光可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。红色荧光越多，绿色荧光越少，则从自噬体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。
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图5.mCherry-GFP-LC3B双标系统工作原理 (Tom Egil Hansen and Terje Johansen，BMC Biology，2011) |
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8. 维真自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图
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图6.维真自噬双标系统感染诱导自噬的HEK293细胞效果图 |
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