慢病毒感染步骤

　　包装细胞系：293FT

　　生长培养基：DMEM+10%HI FBS+1%P/S+0.5mg/mlG418

　　4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐 慢病毒培养基：DMEM+10%HI FBS(无抗生素)

　　4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐 目的细胞培养基： DMEM 或者其他培养基+10%FBS，不含抗生素。

　　转染过程：

　　第一天：准备DNA-lipofectamine 2000复合物

　　a.准备一个5ml EP管，各加入1ug pLP 1 , pLP 2，pLP/SVG以及1ug的慢病毒表达质粒，在50ul(250ul)的OPTI-MEM培养基里面。

　　b. 准备一个5ml EP管，加入10ul(6ul) lipofectamine 2000,在50ul(250ul) OPTI-MEM培养基里面.(轻轻混匀，室温放置5min) c.将步骤a和步骤b轻轻混匀

　　d.室温放置20min,使其充分形成脂质体复合物，可能会出现浑浊，但是不影响转染

　　e.在形成脂质体复合物的过程中，消化，计数293FT，将细胞稀释在慢病毒培养基中，调整至1.2x106/ml。

　　f.在6孔板中，加入DNA-脂质体复合物100ul(500ul)以及慢病毒培养基0.9ml g.添加0.9ml细胞悬液(大约1x106)至6孔板中。轻轻混匀，37℃培养过夜。

　　第二天

　　换液，将培养液(含脂质体)换掉，加入慢病毒培养基2ml,培养48h,观察细胞融合状况。 注意：换液动作一定要轻，换液不用PBS洗

　　第三天

　　将待转染的细胞(BE2-C，SHEP1)用不含抗生素培养基培养，并用合适的浓度，等到第二天大约在30%的密度

　　第四天

　　a. 收293FT细胞产生的病毒上清液，用0.45um的微孔滤膜过滤，然后再向293FT细胞里

　　面加入慢病毒培养基

　　b. 感染细胞，加入1ml的慢病毒培养基以及1ml的病毒液，终浓度为4ug/ml polyberne c. 剩下的病毒液用1.5ml的离心管于-80℃保存，可以保存一年，当用的时候需要融化的时

　　候，室温溶解比37℃溶解要好。

　　第五或者第六天：第二次感染(重复第四天的操作)

　　第六或者第七天：将细胞放置于新鲜的目的细胞培养基中培养 第七天或者第八天：药物选择