维真Cre-loxP重组系统腺相关病毒产品说明

一．Cre-loxP重组系统作用原理

1.     Cre重组酶和loxP位点

Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点。

LoxP（locus of X-overP1）位点长为34bp，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。

图1. Cre重组酶和loxP位点

（http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design）

2.     Cre-loxP重组系统诱导基因重组的方式

Cre-loxP系统存在几种诱导重组的方式，这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。

当基因组内存在loxP位点时，一旦有Cre重组酶，便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随后，loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下，切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。主要存在几下几种重组方式：

（1）       两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列；

（2）       两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转；

（3）       两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；

（4）       四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。

图2. Cre-loxP诱导基因重组的方式

（https://www.tumblr.com/search/rolling%20circle%20replication）

二．维真Cre-loxP重组系统的AAV载体构建和病毒包装服务

1.       依赖Cre重组酶诱导表达的FLEX-ON系统

结合组织特异性的启动子和不同的AAV血清型，FLEX-ON系统能完成更精准的组织特异性控制和时间控制。

在FLEX-ON系统中，目的基因反方向位于启动子下方，两侧分别连接两个“头对头”的loxP。Cre重组酶不存在时，目的基因不能表达；当Cre重组酶存在时，可以诱导目的基因的“翻转”，从而表达。

图3. 维真提供依赖Cre的FLEX-ON系统示意图

图4. 维真的FLEX-ON实验图

2.       依赖Cre重组酶反式剪接系统——轻松拥有“表达大基因的AAV”

较小的包装能力（小于5kb）使得AAV应用受到限制。维真为您提供依赖Cre的反式剪接系统，让您轻松拥有“表达大基因的AAV”。

多个重组AAV的共转染效率高达90%，维真将较大基因分为两部分构建于两个AAV载体上。通过ITR的重组、mRNA剪接和Cre-loxP消除ITR的对转录的抑制作用，实现目的蛋白的表达。相比于单个载体ViGene提供的依赖Cre的反式剪接系统的表达效率约20%。

图5. 维真提供依赖Cre的反式剪接系统示意图

图6. 维真的依赖Cre的反式剪接系统实验图

三．维真Cre-loxP重组系统AAV操作方法

（一）体外实验

以2型AAV病毒为例，维真为您推荐的MOI值10⁴-10⁵，是根HEK293细胞得出的数据，不同的细胞所使用的病毒MOI值会有所不同。建议您感染目的细胞前，进行预实验摸索最佳MOI值，推荐使用有荧光的对照病毒来摸索条件。

1. 为了节省病毒，推荐使用96孔板进行预实验。

2. 将目的细胞接种于96孔板中，细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保证细胞贴壁过夜。

3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培养基中做1:10稀释（10^-1），以此为起点做梯度稀释直至稀释10^-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。

4. 取出提前准备好的96孔板，先确定细胞生长状况是否良好。用准备好的病毒稀释液替代旧培养基，注意保留未加入病毒的细胞孔作为对照组。

5. 在加入病毒稀释液后，请在12-24h后观察细胞状态来确认加入的病毒量是否合适，是否因为加入的病毒量影响细胞状态。如果细胞没有变化，即所加病毒对细胞没有毒性，可以继续培养。

6. AAV病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后每天观察细胞中荧光表达情况。

另：如果您选择的产品没有荧光标签请在96小时以后的不同时间段分别收获细胞并通过Western-Blot或其他检测手段来检测基因表达。

注：由于AAV组织特异性，体外感染细胞的效率比较低，所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验。

（二）体内实验

针对小鼠/大鼠来说，研究不同的方向有不同的AAV注射方法，详情可查阅Vigene官网。

四．常见问题解答

1.重组AAV 安全吗?

迄今为止，未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV，在无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

2.哪些血清型的 AAV 可供选择？我该选用哪种AAV呢?

目前为您提供的AAV 血清型为AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 &  AAV9。请参阅下面指南中参考文献的建议。

 

 

请同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表，以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。

3.使用重组腺相关病毒rAAV传递基因的优势是什么?

rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性极小、体内表达外源基因时间长。

4.AAV 载体稳定吗? 如何保存AAV载体? 

纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后，-80℃下长期保存。

5.订制AAV服务，客户需要提供哪些材料? &客户收到的产品是怎样的?

您可以从我们的人源全长cDNA库(17,000预制ORF)中挑选，或者提供您的质粒DNA或DNA序列，我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

基因沉默服务，请您提供确切的shRNA的序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

通常情况下，可为客户提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /mL。也可根据客户的需要，提供特定体积和滴度的产品。