miRNA inhibitors — miRNA功能缺失研究的工具

 

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今天小V带领大家一起认识miRNA功能缺失研究的工具------miRNA inhibitors。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的，大小约20-25个核苷酸，具有调控作用的非编码RNA，是基因表达和多种生物途径的关键调节因子。miRNA inhibitors是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。其易于获得，操作简便，实验周期短，可很好地用于miRNA功能分析研究。

 

 

miRNAs的生成及作用途径

 

 

miRNA首先在细胞核内由miRNA gene转录出较长的初级miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），然后在核内由Drosha加工成60-70个核苷酸的具有发夹结构的RNA，即前体miRNA（miRNA precusor，pre-miRNA），在Exportin-5复合物的帮助下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为成熟的miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物（RISC）中，最后通过与mRNA完全或不完全配对来调节基因表达。

miRNA与mRNA的识别位点主要位于3‘UTR区。不完全的碱基配对主要促进mRNA的降解或翻译抑制，完全或接近完全的碱基配对则对mRNA进行切割。切割位点在miRNA 10-11位核苷酸所对应的mRNA磷酸二酯键上。

到目前为止，在人体中已经发现了2000多种不同的成熟miRNAs（若需了解人源性miRNA质粒和腺病毒产品，可登录维真生物官网查看相关信息）。一个基因可以受不同的miRNAs调控，单个miRNA也可以调控不同的基因。研究显示多种疾病都与miRNA的活性异常有关，其在疾病发展中具有独特的功能意义，并可作为诊断生物标志物或治疗靶点。

 

 

miRNAs功能研究的相关概念

 

A. miRNA mimics

针对miRNA的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA.。作用与miRNA的成熟体是一样，可以上调细胞内相应miRNA的含量。

 

B. miRNA agomir

在化学合成的mimics的基础上，经过特殊的化学修饰升级的产品，更稳定，表达时间更长，可以实现细胞实验，不需要转染试剂，可以直接用于动物实验。

 

C. microRNA inhibitors

化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。能够与成熟miRNA序列竞争性结合，削弱内源miRNA的基因沉默效应，提高蛋白表达量。

miRNA mimics和miRNA agomir可上调miRNA的表达，用于鉴定功能获得表型；microRNA inhibitors则下调miRNA的表达，用于研究功能缺失表型。

 

miRNA mimics 和 miRNA inhibitors 功能示意图

化学合成miRNA mimics和inhibitors是近年来研究的一个新热点，已经成为研究动植物基因家族功能的有用工具，并有望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略。

 

 

miRNA inhibitors的种类（7种）

 

【Bak et al . RNA 2013, 19:280–293】

 

研究发现7种miRNA inhibitors中，TuD和Bulged Sponge对miRNA的抑制能力最强，可被同源miRNA靶向，在时间和空间上调控miRNA的活性。

 

【Bak et al . RNA 2013, 19:280–293】

1. TuD

TuD是一个60 bp长的发夹状RNA：一个18 bp的长茎、两个miRNA结合位点、连接miRNA结合位点的26 nt长茎环结构和四个3 nt的长连接体。内环暴露的两个miRNA结合位点，可以增加对miRNA的抑制（TuD功能及结构示意图如下）。

【Bernardo et al. Frontiers in harmacology 2018, 9:1090】

 

2. Sponge

Sponge 3’ UTR区包含若干个miRNA靶定位点，结合位点数量的增加可增加其与miRNA的结合能力。

Sponge可用于靶点预测的验证，分析miRNA的功能丧失表型。

Sponge由表达质粒编码，可用于慢病毒、腺病毒或转基因等多种形式，以适合各种不同的细胞类型（Sponge功能示意图如下）。

【Bernardo et al. Frontiers in harmacology 2018, 9:1090】

 

 

microRNA inhibitors的应用

 

A.抑制活体microRNA活性来研究功能缺失效应；

B.筛选调控基因表达和影响细胞发育过程的miRNAs；

C.研究miRNA在生物过程中的作用，如细胞的发育、增殖、分化和凋亡；

D.发现和验证内源性的miRNA target；

维真公司现有miRNA inhibitors的种类主要有TuD和Sponge，对应的载体列表如下，欢迎各位老师致电垂询！

 

AAV

pAV-CMV-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-CAG-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-hVMD2-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-aMHC-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-TBG-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-cTNT-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-SM22a-GFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-Insulin1-GFP-miRNA TuD/Sponge

PAV-TBG-RFP-miRNA TuD/Sponge

pAV-CAG-miRNA TuD/Sponge

……

AV

pENTER-CMV-RFP-miRNA TuD/Sponge

pENTER-CMV-GFP-miRNA TuD/Sponge

pADM-CMV-GFP-miRNA TuD/Sponge-mCMV-GFP

……

LV

pLent-EF1a-Puro-CMV-GFP-miRNA TuD/Sponge

pLent-EF1a-Puro-CMV-RFP-miRNA TuD/Sponge

pLent-EF1a-Puro-CMV-Luciferase-miRNA TuD/Sponge

pLent-EF1a-Luciferase-miRNA TuD/Sponge-CMV-Puro

pLent-EF1a-GFP-miRNA TuD/Sponge-CMV-Puro

……

 

参考文献

 

1. Potent microRNA suppression by RNA Pol II-transcribed ‘Tough Decoy’ inhibitors；

2. Long-term, efficient inhibition of microRNA function in mice using rAAV vectors；

3. Generation of MicroRNA-34 Sponges and Tough Decoys for the Heart: Developments and Challenges；

4. MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells.